3A-Zusammenbau

Der Drei-Antibiotika-Zusammenbau (3A-Zusammenbau) ist eine Methode zum Zusammenbau von zwei BioBricks mittels Restriktionsenzym-Klonierung. Drei verschiedene Antibiotikaresistenzen ermöglichen eine effiziente Selektion für den korrekten Zusammenbau durch Antibiotika. Beim 3A-Zusammenbau werden die Restriktionsstellen am Präfix und Suffix verwendet, um die beiden Teile zusammenzufügen.

Eine wirksame Antibiotikaselektion macht die Gelreinigung und die Kolonie-PCR der resultierenden Kolonien überflüssig. Theoretisch sollten etwa 97 % der Kolonien den gewünschten Aufbau aufweisen.

Methode

Für einen erfolgreichen Zusammenbau benötigt man zwei Teile und ein Grundgerüst mit verschiedenen Antibiotikaresistenzgenen (in Abbildung 1 durch gelbe Pfeile symbolisiert).

Abbildung 1: 3A-Zusammenbau (Urheberschaft iGEM.org)

• Restriktionsverdau

  • Die linke Teilprobe wird mit EcoRI (E) und SpeI (S) ausgeschnitten.

  • Die rechte Teilprobe wird mit XbaI (X) und PstI (P) ausgeschnitten.

  • Das Plasmid-Rückgrat wird mit EcoRI (E) und PstI (P) ausgeschnitten. In dem Beispiel in Abbildung 1 wird ein linearisiertes Plasmidrückgrat verwendet. Alternativ kann auch ein Plasmid verwendet werden, das ein ccdB-Gen enthält.

• Alle 3 Restriktionsverdaue werden erhitzt, um alle Restriktionsenzyme abzutöten.

• Ligation: Eine äquimolare Menge aller 3 Restriktionsverdau-Produkte wird in einer Ligationsreaktion kombiniert. Das gewünschte Ergebnis ist, dass der SpeI-Überhang der linken Teilprobe mit dem XbaI-Überhang der rechten Teilprobe ligiert wird, wodurch eine Narbe entsteht, die mit keinem unserer Enzyme geschnitten werden kann. Die neue zusammengesetzte Teilprobe wird an den EcoRI- und PstI-Stellen in das Konstruktionsplasmid-Grundgerüst ligiert.

• Wenn die Ligation in Zellen transformiert und auf Platten mit Antibiotikum C gezüchtet wird, überleben nur Kolonien mit der korrekten Konstruktion.