cDNA-Synthese
cDNA (komplementäre DNA) ist komplementär zur mRNA und wird durch das Enzym Reverse Transkriptase (RT) aus der mRNA-Vorlage synthetisiert. Da sie auf mRNA basiert, enthält cDNA nur die exprimierten Abschnitte eines Gens, im Gegensatz zu genomischer DNA, die die gesamte Gensequenz enthält.
Bei der Untersuchung von proteinkodierenden Regionen des Genoms stellt die Arbeit mit mRNA einige Herausforderungen dar. Am wichtigsten ist, dass RNA aufgrund der allgegenwärtigen RNasen leicht abgebaut wird. Daher schafft die reverse Transkription von mRNA in cDNA eine stabilere und zuverlässigere Probe für die Analyse dieses Genomabschnitts, zum Beispiel durch PCR. Vor allem aber erfordern PCR-basierte Techniken wie Sequenzierung und qPCR den Einsatz von DNA-Polymerasen, die cDNA, nicht aber mRNA als Substrat verwenden können.
Der für die cDNA-Synthese aus mRNAs verwendete Primer ist in der Regel ein Oligo(dT)-Primer, der sich an den polyA-Schwanz von mRNA-Molekülen anlagern kann. Manchmal werden auch zufällige Hexamer-Primer verwendet, die je nach Sequenz des Hexamers zufällig an jede RNA in der Probe binden würden. Nach der cDNA-Synthese wird ein DNA-RNA-Hybrid gebildet. Schließlich wird die RNA durch RNaseH verdaut, so dass ein einzelsträngiges cDNA-Molekül entsteht, das direkt in jeder PCR-basierten Technik verwendet werden kann. Wird eine doppelsträngige cDNA benötigt, kann sich die resultierende einzelsträngige DNA auf sich selbst zurückfalten und das 3er-Ende bindet an eine komplementäre Sequenz auf demselben Strang. Die resultierende doppelsträngige DNA dient als Primer für die DNA-Polymerase, die den komplementären Strang produziert.
Bei der reversen Transkription von mRNA, die aus einer Gewebeprobe isoliert wurde, werden alle mRNA-Moleküle transkribiert. Daher führen sehr reichlich vorhandene mRNA-Kopien (aufgrund hoher Genexpression) zu sehr reichlich vorhandenen cDNA-Kopien. Ebenso werden Gene, die nicht exprimiert werden, d. h. von denen nur wenige oder gar keine mRNA-Kopien transkribiert werden, in der cDNA-Probe nicht vertreten sein.