Clusterbildung
Nach Abschluss der NGS-Probenvorbereitung muss die DNA auf einer Chipoberfläche verankert werden, wo sie erneut vervielfältigt und dann sequenziert wird. Diese Chipoberfläche wird auch als Fließzelle bezeichnet (siehe Abbildung 1 unten). An der Oberfläche der Fließzelle sind zahlreiche kurze DNA-Moleküle angebracht, wodurch ein Bereich mit sehr hoher Dichte entsteht.
Auf der Oberfläche der Fließzelle sind zwei kurze DNA-Sequenzen angebracht (hier in grün und gelb). Jedes dieser kurzen DNA-Moleküle ist komplementär zu einem Strang des Adapters, der zuvor der DNA-Probe hinzugefügt wurde, und ermöglicht so eine spezifische Bindung an die Fließzelle. Ein Adapter bindet an das grüne Molekül, während der andere Adapter an das gelbe Molekül bindet.
Abbildung 1: Fließzelle mit hoher Dichte an kurzen DNA-Strängen, die an der Oberfläche haften
Schritte der Clusterbildung
Nachdem die DNA-Moleküle an die Fließzelle gebunden sind, finden zwei Schritte statt. Zu beachten ist, dass die unterschiedliche Farbgebung in Abbildung 1 und Abbildung 2 irrelevant ist, da sie lediglich zeigt, dass zwei verschiedene kurze DNA-Moleküle an die Fließzelle gebunden sind.
1. Brücken-PCR
Die an den Andock-DNA-Strang (blau) gebundene DNA-Probe (gelb) biegt sich und bindet an ein benachbartes komplementäres Andock-DNA-Strang-Molekül (lila), wodurch eine „Brücke“ entsteht (siehe Abbildung 2). Eine Polymerase heftet sich dann an das violette Molekül und verwendet es als Vorlage, um eine komplementäre Kopie zu erstellen. Die Brücke wird dann gebrochen, und jedes der DNA-Moleküle ist nun nur noch an ein kurzes DNA-Molekül gebunden. Der Vorgang wird mehrmals wiederholt, sodass ein Cluster entsteht. In diesem Cluster finden wir DNA-Proben, die an die blaue Andock-DNA und an die violette Andock-DNA-Sequenz gebunden sind. Nach der Brücken-PCR-Verstärkung befinden sich in jedem Cluster etwa 4000 DNA-Moleküle, von denen jedoch die Hälfte weggewaschen wird, wodurch nur 2.000 DNA-Moleküle pro Cluster übrig bleiben.
Abbildung 2: Clusterbildung mit Brücken-PCR und Amplifikation
2. Spülung
Im Moment haben wir zwei komplementäre DNA-Stränge, die an die Oberfläche der Fließzelle gebunden sind. Wir wollen aber nur einen von ihnen sequenzieren (zum Beispiel nur die DNA, die an die blaue Andock-DNA-Sequenz gebunden ist). Wir werden die anderen DNA-Moleküle, die an das violette Molekül gebunden sind, spülen, d. h. wir werden mit DNA-Molekülen fortfahren, die mit derselben Ausrichtung synthetisiert wurden. In jedem Cluster finden wir nur DNA, die an das blaue Molekül gebunden ist, und sie sind identisch, weil sie klonal amplifiziert wurden. Am Ende des Schrittes der Clusterbildung können wir davon ausgehen, dass etwa 200 Millionen klonal amplifizierte DNA in einer Fließzelle geclustert sind. Damit steht eine große Menge an DNA für die Sequenzierung während des NGS-Prozesses bereit.