Clusterbildung

Nach Abschluss der NGS-Probenvorbereitung muss die DNA auf einer Plattenoberfläche verankert werden, wo sie erneut amplifiziert und anschließend sequenziert wird. Diese Plattenoberfläche wird auch als Durchflusszelle bezeichnet und weist eine hohe Dichte an kurzen DNA-Strängen auf, die an ihrer Oberfläche angebracht sind. Die DNA-Moleküle können an einen Adapter auf der Durchflusszelle binden, da die Sequenzen komplementär sind.

SCHRITTE DER CLUSTERBILDUNG:

Nachdem die DNA-Moleküle an die Durchflusszelle gebunden sind, erfolgen zwei Schritte.

Brücken-PCR

Das DNA-Molekül, das an das kurze DNA-Molekül gebunden ist (als blaues Molekül dargestellt), biegt sich um und bindet an das andere Molekül (als violettes Molekül dargestellt), wodurch eine „Brücke“ entsteht (siehe Abbildung 1). Eine Polymerase heftet sich dann an das violette Molekül und amplifiziert die DNA, wobei zwei zueinander komplementäre DNA-Moleküle entstehen. Die Brücke wird dann gelöst, und jedes der DNA-Moleküle ist nur noch an ein kurzes DNA-Molekül gebunden. Der Vorgang wird mehrmals wiederholt, so dass ein Cluster entsteht, in dem beide DNAs zu finden sind: DNA-Moleküle, die an das blaue Molekül gebunden sind, und DNA-Moleküle, die an das violette Molekül gebunden sind. Nach der Brücken-PCR-Verstärkung befinden sich in jedem Cluster etwa 4.000 DNA-Moleküle, von denen jedoch die Hälfte weggewaschen wird, so dass nur 2.000 DNA-Moleküle pro Cluster übrig bleiben. Dieser Schritt wird im Folgenden beschrieben.

Waschen

Im Moment haben wir zwei komplementäre DNA-Stränge, die an der Oberfläche der Durchflusszelle anhaften. Wir wollen aber nur Cluster mit identischer (klonaler) DNA sequenzieren (z. B. nur DNA, die an das blaue Molekül gebunden ist). Die anderen DNA-Moleküle, die an das violette Molekül gebunden sind, werden wir wegwaschen; wir haben also nur noch DNA-Moleküle, die mit der gleichen Ausrichtung synthetisiert wurden. Jetzt finden wir in jedem Cluster nur DNAs, die an das blaue Molekül gebunden sind, und diese sind identisch, weil sie klonal amplifiziert wurden. Am Ende der Clustergenerierung können wir davon ausgehen, dass sich in einer Durchflusszelle etwa 200 Millionen klonal amplifizierte DNA-Cluster befinden. Das ist eine Menge DNA, die für die Sequenzierung bereitsteht!

Abbildung 1. Clusterbildung mit Brücken-PCR und Amplifikation.