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Kompetitive Inhibition

Die doppelt-reziproke Gleichung für kompetitive Inhibition lautet wie folgt:

1/V0 = 1/Vmax + Km • α/Vmax • 1/[S] wobei α = 1 + I/ KI ist.

Ausgehend von dieser Gleichung sollte ein doppelt reziprokes Diagramm eine gerade Linie mit dem Achsenabschnitt 1/ Vmax und der Steigung Km - α / Vmax ergeben. Verschiedene Lineweaver-Burk-Diagramme mit unterschiedlichen Inhibitor-Konzentrationen sollten daher unterschiedliche Steigungen ergeben (weil α mit der Inhibitor-Konzentration zunimmt), aber denselben y-Abschnitt. Das bedeutet, dass Vmax bei verschiedenen Konzentrationen eines kompetitiven Inhibitors unverändert ist, der scheinbare Km, Km(app) (Km(app) = Km - α), jedoch unterschiedlich ist. Wenn doppelt-reziproke Diagramme von 1/V0 gegen 1/[S] bei unterschiedlichen Inhibitor-Konzentrationen gerade Linien mit unterschiedlichen Steigungen, aber demselben y-Abschnitt ergeben, ist der Inhibitor kompetitiv (Abbildung 1) [1].

Links siehst du ein Lineweaver-Burk-Diagramm mit 1 geteilt durch V auf der y-Achse und 1 geteilt durch die Konzentration des Substrats auf der x-Achse. Das Diagramm zeigt die kompetitive Inhibition als drei verschiedene Linien in den Farben Grün, Blau und Rot. Diese Linien stellen verschiedene Diagramme mit unterschiedlichen Inhibitor-Konzentrationen dar und haben daher unterschiedliche Steigungen. Alle drei Linien schneiden sich jedoch an der gleichen Stelle auf der y-Achse. Die grüne Linie hat eine höhere Inhibitor-Konzentration und steigt daher schneller an als die beiden anderen Linien. Die blaue Linie hat eine niedrigere Inhibitor-Konzentration als die grüne Linie, aber eine höhere Konzentration als die rote Linie, die am langsamsten ansteigt. Auf der rechten Seite ist ein weiteres Diagramm zu sehen, in dem die Steigungen der einzelnen linearen Regressionen gegen die Konzentration des Inhibitors aufgetragen sind. Das Diagramm zeigt, dass mit zunehmender Inhibitor-Konzentration auch die Steigung der linearen Regressionslinie zunimmt

Abbildung 1: Abbildung a; Lineweaver-Burk-Diagramm zeigt die kompetitive Inhibition. Abbildung b: Zeigt die Steigungen der einzelnen linearen Regressionen, aufgetragen gegen die Konzentration des Inhibitors.

Berechnung von KI, Km, und Vmax

Wenn der Inhibitor kompetitiv ist, muss nur 1 Inhibitor-Konstante berechnet werden. Um die Inhibitor-Konstante zu berechnen, müssen mehrere Versuche mit unterschiedlichen Inhibitor-Konzentrationen durchgeführt werden. Jeder der resultierenden Datensätze sollte in ein Diagramm eingetragen werden, und die Steigungen und y-Achsenabschnitte können durch lineare Regression bestimmt werden. Aus diesen Anpassungen kann Vmax als Kehrwert der y-Achsenabschnitte berechnet werden. Wenn keiner der kinetischen Parameter bestimmt wurde, liefert diese lineare Anpassung nicht genügend Informationen, um KI und Km zu bestimmen. Um diese Parameter zu bestimmen, müssen die "Steigungen" der verschiedenen Tests gegen die Konzentration des Inhibitors in ein Diagramm eingetragen werden. Dabei wird die folgende Gleichung zugrunde gelegt:

Steigung kompetitiv = Km • α/Vmax = Km/Vmax + Km/Vmax • 1/KI • [I]

Dieses Diagramm sollte daher auch eine Gerade mit dem Schnittpunkt Km / Vmax und der Steigung (Km / Vmax ) - 1 / KI ergeben. KI kann also berechnet werden, indem der y-Achsenabschnitt durch die Steigung geteilt wird. Da Vmax bereits berechnet wurde, kann Km aus dem y-Achsenabschnitt dieser Anpassung berechnet werden, indem dieser mit Vmax multipliziert wird.

Schritte zur Berechnung der kinetischen Parameter bei der Verwendung eines kompetitiven Inhibitors

Erstelle Lineweaver-Burk-Diagramme der kinetischen Daten und trage die Daten mithilfe der linearen Regression ein (1 Anpassung pro Inhibitor-Konzentration). Die y-Achsen der Lineweaver-Burk-Diagramme für die verschiedenen Konzentrationen der Inhibitoren sollten identisch sein (oder zumindest nahe beieinander liegen). Nimm den Kehrwert des y-Achsenabschnitts; das ist Vmax. Trage die Steigungen dieser Linien als Funktion der Inhibitor-Konzentration in ein neues Diagramm ein und setze dieses Diagramm mit Hilfe der linearen Regression ein. Um Km zu berechnen, multiplizierst du den y-Achsenabschnitt dieser Linie mit Vmax. Um KI zu berechnen, teilst du den y-Achsenabschnitt dieser Linie durch die Steigung.

Quellen

  1. Lehninger, Albert L.; Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2008). Principles of Biochemistry (5th ed.). New York, NY: W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.

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