DNA-Isolierung
Die DNA-Isolierung aus Zellen kann mit der Phenol-Chloroform-Methode durchgeführt werden. Diese Methode ergibt eine genomische DNA, die Millionen von Genen enthält. Um ein bestimmtes Gen von Interesse aus der genomischen DNA zu isolieren, kann eine PCR mit spezifischen Primern durchgeführt werden. Wenn das betreffende Gen in einem Vektor vorliegt, kann ein spezifisches Restriktionsenzym für die Isolierung verwendet werden.
Phenol-Chloroform-Extraktion
Nukleinsäuren aus Zellen können mit der Phenol-Chloroform-Methode isoliert werden. Phenol-Chloroform ist eine Mischung aus puffergesättigtem Phenol und Chloroform im Verhältnis 1:1. Der erste Schritt der Extraktion ist die Zelllyse und Homogenisierung in wässriger Lösung. Dann wird das Phenol-Chloroform-Gemisch zugegeben, wodurch zwei Phasen entstehen, die durch Zentrifugation weiter getrennt werden. Gereinigtes Phenol hat eine Dichte von 1,07 g/cm3, während Chloroform eine höhere Dichte hat (1,47 g/cm3). Daher entstehen bei der Zentrifugation zwei Phasen: die untere organische Phase und die obere wässrige Phase.
Nukleinsäuren erhalten ihre Polarität durch das negativ geladene Phosphatgerüst; daher sind Nukleinsäuren in der oberen wässrigen Phase löslich. Proteine enthalten hydrophobe Bereiche, die mit Phenol in Wechselwirkung treten und dazu führen, dass die Proteine an der Grenzfläche zwischen zwei Phasen ausfallen (oft als weiße Ausflockung). Lipide haben ebenfalls einen hydrophoben Bereich und lösen sich in der unteren organischen Phase auf. Der pH-Wert des Gemischs bestimmt die Trennung der Nukleinsäuren. Bei neutralem pH-Wert bleiben RNA und DNA in der oberen wässrigen Phase, bei saurem pH-Wert wandert die DNA in die untere organische Phase und die RNA bleibt in der oberen wässrigen Phase. Im letzten Schritt werden die Nukleinsäuren durch Ausfällung mit Isopropanol aus der wässrigen Phase gewonnen.
NanoDrop
Der DNA-Ertrag (oder die DNA-Konzentration) und die Reinheit können durch Messung der Absorption mit einem Spektralphotometer bestimmt werden. NanoDrop ist ein Spektralphotometer, das die Absorption von 0,5-2 μl messen kann, indem es ein Probenrückhaltesystem verwendet. Das Probenrückhaltesystem ermöglicht die Messung von Proben mit hoher Konzentration ohne Verdünnung. Die Absorption wird bei 260 nm (A260) gemessen, wo die DNA das Licht am stärksten absorbiert. Die Menge des absorbierten Lichts ist proportional zur DNA-Menge in der Probe.
Die Beziehung wird durch das Beer-Lambert-Gesetz beschrieben: c = (A * ε)/b
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c : die Nukleinsäurekonzentration in ng/μl.
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A : die Absorption in AU
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ε : der wellenlängenabhängige Extinktionskoeffizient in ng-cm/μl
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b : die Schichtdicke in cm
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Der Extinktionskoeffizient von doppelsträngiger DNA beträgt 50ng-cm/μl
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In diesem Fall beträgt die Schichtdicke des NanoDrop 10 mm.
Die Reinheit der DNA kann bewertet werden, indem sie bei λ = 280 nm, λ = 230 nm und λ = 320 nm gemessen und das Verhältnis für 260/280 nm , 260/230 nm und 260/320 nm berechnet wird. Nukleinsäuren absorbieren Licht bei 260 nm stark, während organische Verunreinigungen wie Phenol und Trizol Licht bei 230 nm und Proteine Licht bei 280 nm absorbieren. Weder Nukleinsäuren noch Proteine absorbieren Licht bei 320 nm.
Für 260/280 gilt ein Verhältnis von etwa 1,8 als reine DNA, während für reine RNA ein Verhältnis von etwa 2 gilt. Für 260/320 bedeutet ein Verhältnis von 1,8-2,2 im Allgemeinen, dass die Nukleinsäureprobe als rein gilt. Bei 260/230 bedeutet ein Verhältnis von <1,8, dass organische Verunreinigungen in erheblichem Umfang vorhanden sind.