DNA-Sequenzierung

Die Sequenzierung ist eine Technik zum „Ablesen“ der genauen Reihenfolge der Nukleotide in einem DNA-Fragment. Kleine DNA Fragmente, ganze Gene oder sogar Genome können sequenziert werden.

Die am weitesten verbreitete DNA-Sequenzierungstechnik basiert auf der von Sanger entwickelten Kettenterminierung. Diese Methode ist der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sehr ähnlich, verwendet aber nur einen Primer, der in der Nähe der zu untersuchenden Region am 3er-Ende der DNA-Vorlage andockt (Abbildung 1). Während der Sequenzierungsreaktion wird eine Mischung aus normalen Nukleotiden (dATP, dTTP, dCTP und dGTP) und „Stopp“-Nukleotiden (ddATP, ddTTP, ddCTP und ddGTP) zur DNA-Vorlage hinzugefügt. Die Stop-Nukleotide sind jeweils mit einer bestimmten Farbe markiert. In jedem Zyklus wird die Ziel-DNA durch eine DNA-Polymerase repliziert, bis ein Stopp-Nukleotid hinzugefügt wird, das die weitere Verlängerung stoppt (Kettenterminierung). Nach 35 Zyklen ist eine große Anzahl von Fragmenten in allen möglichen Längen entstanden. Diese Fragmente werden in ein spezielles Acrylamidgel gegeben, wo ihre Länge und „Endbasen“ festgestellt werden. Da die Fragmente aufgrund ihrer Größe im Gel aufgetrennt werden, werden die markierten Nukleotide nacheinander nachgewiesen, sodass die genaue DNA-Sequenz im Fragment rekonstruiert werden kann.

Der Zweck der Sequenzierung ist beispielsweise die Vorhersage der Proteinsequenz eines Gens, der Vergleich von Arten auf Sequenzebene (Gene oder Genom) oder die Suche nach einer Mutation.

Abbildung 1: Schematischer Überblick über die Sanger-Methode (Kettenterminierung) zur DNA-Sequenzierung

Während der Elongationszyklen werden DNA-Fragmente aller möglichen Längen produziert, die jeweils mit einem farbigen Stopp-Nukleotid terminiert werden. Wenn die Fragmente entsprechend ihrer Größe auf einem Gel getrennt werden, zeigt die Reihenfolge der Farben die genaue DNA-Sequenz an.