Parameter für die Elektroporation

Spannung

Die elektrischen Bedingungen für die Elektroporation sind für jeden Mikroorganismus unterschiedlich. Für Hefe, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae, ist die optimale elektrische Bedingung 40 μl Zellen, 1,5 kV für etwa 5 ms.

Zellen

Elektrokompetente Zellen werden verwendet, um die Effizienz der Elektroporation zu erhöhen. Hefezellen werden durch Waschen elektrokompetent gemacht, wobei eine nichtionische Lösung verwendet wird, um alle Salze zu entfernen. Dieses Verfahren stellt sicher, dass die Ladung nicht durch das Medium geleitet wird. Die optimale Elektroporation für Hefe wird erreicht, wenn Hefe in der mittleren oder späten logarithmischen Phase verwendet wird. Die logarithmische Phase der Hefe kann in drei Teile unterteilt werden:

• Frühe Log-Phase: der Zeitraum, in dem die Zelldichten etwa 10⁷ Zellen/ml betragen.
• Mittlere Log-Phase: Die Kulturen weisen Dichten zwischen 1 und 5 × 10⁷ Zellen/ml auf.
• Spätlog-Phase: tritt auf, wenn die Zelldichten zwischen 5 × 10⁷ und 2 × 10⁸ Zellen/ml liegen.

In der logarithmischen Phase ist die Wachstumsrate schnell, und die Zellteilungsrate übersteigt die Zelltodrate. Die Zellen sind stoffwechselaktiv und verfügen über eine ausreichende Genomreplikation, um eine effiziente DNA-Reparatur durchzuführen. Daher können Zellen in dieser Phase eine harte Behandlung wie Elektroporation vertragen.

DNA

Die Häufigkeit der Transformation wird durch Erhöhung der DNA-Konzentration im Elektroporationspuffer erhöht. Allerdings kann eine zu hohe DNA-Konzentration die Effizienz der Transformation verringern. Die genaue DNA-Konzentration muss für jedes Experiment bestimmt werden.

Elektroporationsmedien

Um eine Lichtbogenbildung während der Elektroporation zu vermeiden, ist es wichtig, die elektrokompetente Zelle gründlich zu waschen, um das Wachstumsmedium aus der Zelle zu entfernen. Das Waschen kann mit Wasser oder einer nicht ionischen Lösung wie Glucose, Glycerin, Saccharose, Sorbitol oder Polyethylenglycol erfolgen. Das Vorhandensein von ionischem Material kann während der Elektroporation zu Lichtbogenbildung führen.

Vorzugsweise wird Sorbitol verwendet, weil es als nicht durchdringendes Kryoprotektivum wirkt, das die Schädigung der Zellmembran beim Auftauen erheblich reduziert. Schäden an der Membran verringern die Transformationseffizienz erheblich.

Während des Elektroporationsverfahrens steigt die Temperatur an, und die Zellen erleiden Membranverletzungen, die durch schnellen Wasserein- und -ausfluss aufgrund eines großen extrazellulären und intrazellulären osmotischen Ungleichgewichts verursacht werden. Diese Art von Schädigung kann mit einem osmotischen Stabilisator wie Sorbitol verhindert werden. Sorbitol wirkt also als Kälteschutzmittel und Osmoregulator.