Labster Logo

Kinetischer Enzymtest

Die Enzymkinetik beschäftigt sich mit der Erforschung der Mechanismen von Enzymen durch die Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit unter verschiedenen Bedingungen. Die Geschwindigkeit einer Reaktion hängt von mehreren Faktoren ab, darunter die Konzentration des Substrats und des Enzyms, die Temperatur, der pH-Wert und die Anwesenheit von Inhibitoren. [1]

Oben siehst du eine Abbildung der Michaelis-Menten-Sättigungskurve. Auf der x-Achse steht die Substratkonzentration und auf der y-Achse die Reaktionsgeschwindigkeit. In das Diagramm wird eine Michaelis-Menten-Kurve gesteckt, die schnell ansteigt und kurz darauf auf einem Plateau endet. Die Daten sind mit Aufzählungszeichen markiert und eine Linie zwischen ihnen ist blau eingezeichnet. Die Grafik zeigt, dass mit steigender Substratkonzentration auch die Reaktionsgeschwindigkeit zunimmt. Zu Beginn der Reaktion steigt die Reaktionsgeschwindigkeit schnell an, aber wenn die Substratkonzentration weiter ansteigt, verlangsamt sich die Reaktionsgeschwindigkeit und die Kurve beginnt zu stagnieren. An diesem Punkt nähert sich die Reaktion ihrer maximalen Geschwindigkeit, die im Diagramm als V max markiert ist. ½ - V max ist ebenfalls im Diagramm markiert, wo die Reaktion 50% ihrer maximalen Geschwindigkeit erreicht hat. Eine dritte Variable im Diagramm ist k m, das der Substratkonzentration entspricht, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit ½ - V max beträgt. Unten ist eine weitere Grafik zu sehen, bei der die Zeit auf der x-Achse und die Bildung des Produkts auf der y-Achse liegt. Die Kurve spiegelt die allgemeine enzymatische Reaktion wider, die als Veränderung der Konzentration im Laufe der Zeit dargestellt wird. Die Veränderung ist das Ergebnis der Bildung des Produkts, das aus dem Substrat entsteht. Mit zunehmender Zeit steigt das Produkt linear an, bis die Kurve aufgrund der abnehmenden Reaktionsgeschwindigkeit ein Plateau bildet

Abbildung 1: Oben: Michaelis-Menten-Sättigungskurve. Unten: Verlaufskurve einer allgemeinen enzymatischen Reaktion.

Durchführen von kinetischen Tests

Das Ziel eines kinetischen Tests ist es, die Reaktionsgeschwindigkeit, V, als Funktion der Substratkonzentration, [S], zu modellieren, wie in Abbildung 1 dargestellt. Daher ist es notwendig, die Rate bei verschiedenen Substratkonzentrationen zu messen. Für jede Substratkonzentration erhält man eine Verlaufskurve, die die Menge des gebildeten Produkts in Abhängigkeit von der Zeit angibt. Eine solche Verlaufskurve ist in Abbildung 1 dargestellt. Wie die Abbildung zeigt, ist die Reaktionsgeschwindigkeit zu Beginn der Reaktion annähernd konstant. Sobald das Substrat jedoch verbraucht ist, sinkt die Geschwindigkeit und die Verlaufskurve erreicht ein Plateau. Da sich [S] während der Reaktion verändert, werden üblicherweise die Anfangsraten (V0) der Reaktionen gemessen und gegen die Substratkonzentration aufgetragen. V0 wird als die Steigung der Fortschrittskurve zu Beginn der Reaktion gemessen, wenn die Fortschrittskurve noch linear ist [1].

Das einfachste Modell für V als Funktion von [S] ist die Michaelis-Menten-Gleichung. Reaktionen, bei denen die Michaelis-Menten-Gleichung angewendet werden kann, zeigen einen Anstieg der Reaktionsgeschwindigkeit, wenn [S] erhöht wird. Dieser Anstieg nimmt jedoch ab, wenn sich die Geschwindigkeit der maximalen Geschwindigkeit, Vmax, nähert, wie in Abbildung 1 zu sehen. Die Michaelis-Menten-Gleichung wird auf den folgenden Seiten näher beschrieben [1].

Faktoren, die die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussen

Auch die Temperatur und der pH-Wert beeinflussen die Reaktionsgeschwindigkeit. Enzyme haben einen optimalen pH-Wert, der von der Zusammensetzung des Enzyms abhängt. Das liegt an den Eigenschaften der Aminosäureseitenketten des Enzyms: Einige Seitenketten müssen protoniert oder deprotoniert sein, damit ein Enzym funktioniert. Ob eine Aminosäure-Seitenkette protoniert oder deprotoniert ist, hängt vom pKa der Seitenkette und dem pH-Wert der Lösung ab. Histidin hat zum Beispiel einen pKa-Wert von 6,0, was bedeutet, dass es bei einem pH-Wert von <6,0 überwiegend protoniert und bei einem pH-Wert von >6,0 überwiegend deprotoniert wird. Beachte, dass der pKa von Seitenketten durch die Umgebung verändert werden kann. Daher ist der pKa der Seitenketten in Enzymen normalerweise nicht derselbe wie der der freien Aminosäuren. Die Temperatur wirkt sich ebenfalls auf die Reaktionsgeschwindigkeit aus: Ein Temperaturanstieg führt zu einer höheren Reaktionsgeschwindigkeit; ab einer bestimmten Temperatur beginnt das Enzym jedoch zu denaturieren, so dass die Reaktionsgeschwindigkeit oberhalb dieser Temperatur abnimmt [1].

Der Simulator

In diesem Fall verwendest du einen Simulator, um die kinetischen Experimente durchzuführen. Dieser Simulator basiert auf einem mathematischen Modell und ist daher "perfekt", d.h. er führt zu keinen experimentellen Fehlern. Das ist natürlich nicht so, wie das Ergebnis eines kinetischen Enzymtests im wirklichen Leben ablaufen würde. Dort sind solche perfekten Daten unrealistisch.

Quellen

  1. Lehninger, Albert L.; Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2008). Principles of Biochemistry (5th ed.). New York, NY: W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.

Theorieübersicht