Fragmentierung

Eine der Grenzen des Next Generation Sequencing ist die Länge der DNA-Probe. Aktuell kann die Illumina-Methode bis zu 250 BP sequenzieren. Unser Genom ist aber viel länger: Das längste Chromosom, das Chromosom 1, ist zum Beispiel fast 250 Millionen BP lang. Daher muss die DNA bei der Probenvorbereitung für das NGS fragmentiert bzw. auf eine kürzere Länge zugeschnitten werden. Dieser Schritt wird in der Regel als Fragmentierungsschritt bezeichnet.

Kürzere DNA-Proben, z. B. Proben alter DNA, müssen hingegen nicht fragmentiert werden, da sie bereits teilweise degradiert und nur noch etwa 50 BP kurz sind. Ein weiteres Beispiel hierfür ist cDNA, die aus miRNA (microRNA) gewonnen wird, die ebenfalls sehr kurz ist.

Es gibt zwei Möglichkeiten, DNA zu fragmentieren

Beschallung:

Bei der Beschallung oder Sonikation wird die DNA fragmentiert, indem sie Schallwellen (in der Regel Ultraschallwellen) ausgesetzt wird. Wenn eine starke Schallwelle auf den DNA-Strang trifft, entstehen Doppelstrangbrüche, die den langen DNA-Strang in kleinere DNA-Stränge zerteilen. Um eine bestimmte DNA-Größe zu erhalten, müssen die Beschallungsstärke und die -dauer entsprechend angepasst werden.

Enzymatisch:

Lange DNA-Stränge können auch durch enzymatische Reaktionen fragmentiert werden. Es gibt verschiedene Enzyme, die in der Lage sind, DNA-Stränge zu schneiden. Sie können gezielt bestimmte Sequenzen ansteuern oder die DNA nach dem Zufallsprinzip zerschneiden.