Gateway-Klonierung

Die Gateway-Technologie bietet einen schnellen und effizienten Weg zum Klonieren. Diese Technologie beruht auf der Verwendung von modifizierten Versionen der Rekombinasen des Bakteriophagen Lambda. Dieses Virus fügt sein Genom mithilfe dieser Enzyme in die DNA des Wirts ein. Das Gateway-Klonierungssystem nutzt sie, um eine hocheffiziente, ortsspezifische Rekombination zu erreichen. Das zweite nützliche Merkmal dieses Systems sind die Erkennungsstellen für die Klonase-Enzyme, die so genannten att-Stellen (attachment sites oder Verbindungsstellen), und die Verwendung verschiedener Arten von Vektoren.

Sieh dir die folgende Animation an, um einen Überblick über die Gateway-Reaktion zu erhalten.

BP- und LR-Reaktionen

Bei BP- und LR-Reaktionen werden verschiedene DNA-Abschnitte innerhalb der Konstrukte von einem Ort zum anderen verschoben. Bei der BP-Reaktion werden die attB- und attP-Stellen rekombiniert. Bei dieser Reaktion wird die DNA zwischen den Strängen ausgetauscht, wodurch eine attL- und eine attR-Stelle entstehen. Bei der LR-Reaktion werden die attL- und attR-Stellen auf ähnliche Weise rekombiniert, sodass attB- und attP-Stellen entstehen. Es gibt eine begrenzte Anzahl von att-Stellen, die mit Nummern versehen sind. Dies bedeutet, dass es eine begrenzte Anzahl von Kombinationen gibt. Jede Stelle rekombiniert nur innerhalb der Gruppe: attL1-Stellen rekombinieren z. B. nur mit attR1-Stellen und ergeben attB1- und attP1-Stellen. Die Ausrichtung dieser Stellen ist ebenfalls spezifisch und das Genkonstrukt sehr vorhersehbar. Das gewünschte Konstrukt kann durch Auswahl der richtigen att-Enden, der Reaktionen und der Vektoren erstellt werden.

Vektortypen

Die wiederverwendbaren att-Stellen eignen sich hervorragend für die Erstellung von Vektorbibliotheken, mit denen sich verschiedene Schaltkreisteile effizient kombinieren lassen.

• Expressions-Vektor (AmpR): Der Expressionsklon ist das Endprodukt einer Gateway-Reaktion. Er ist das vollständige Plasmid, das zur Transformation bereit ist.

• Donor-Vektor (ccdB, KanR): Der Donor-Vektor bildet das Grundgerüst für die Erzeugung von Entry-Klonen. Donor-Vektoren werden in der Regel mit Namen bezeichnet, die mit pDONR beginnen. Diese Plasmide tragen attB- oder attP-Stellen, die das ccdB-Gen flankieren, sowie das Kanamycin-Resistenzgen.

• Entry-Vektor (KanR): Die Entry-Vektoren werden aus dem Donor-Vektor und einer DNA-Sequenz hergestellt, die mit den passenden att-Stellen flankiert ist. Diese fraglichen Sequenzen werden in der Regel durch PCR mit Primern hergestellt, die die att-Stellen enthalten. Entry-Vektoren enthalten attL- oder attR-Stellen, die die betreffende Sequenz flankieren, sowie das Kanamycin-Resistenzgen. Die Entry-Vektoren sind ideal für eine Bibliothek von Schaltkreisteilen geeignet.

• Ziel-Vektor (ccdB, AmpR): Der Ziel-Vektor bildet das Grundgerüst für Expressionsklone. Ziel-Vektoren werden in der Regel mit Namen bezeichnet, die mit pDEST beginnen. Diese Plasmide enthalten das ccdB-Gen, das von attL- oder attR-Stellen flankiert wird, sowie ein Ampicillin-Resistenzgen. Ziel-Vektoren enthalten auch die Replikationsursprünge für bestimmte Wirte und zusätzliche DNA-Motive.

Auswahl

Die Auswahl der gewünschten Vektoren in den verschiedenen Schritten des Gateway-Klonierungsverfahrens ist sehr wichtig. Für die Selektion stützt sich das Gateway-System auf zwei Antibiotikaresistenzen und das ccdB-Gen für die positive Selektion. Die Antibiotikaresistenz ermöglicht es den transformierten Zellen, auf einem Medium zu wachsen, das Antibiotika enthält, die nicht transformierte Zellen abtöten.

Klicke hier, wenn du mehr über Ampicillin-Resistenz erfahren möchtest.

ccdB kodiert für ein Bakterientoxin, das die DNA-Replikation verhindert. Alle Grundgerüste für Gateway-Klone (pDEST und pDONR) tragen dieses Gen, und nur Bakterien, die zusätzlich ein ccdA-Gen tragen, wachsen, wenn sie mit diesen Plasmiden transformiert werden.