Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese ist eine Methode, die in Labors zur Trennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe und zur Schätzung dieser Größen verwendet wird. Die DNA, z. B. ein PCR-Produkt, wird in kleine Vertiefungen an einem Ende eines Gels gefüllt. Dann wird ein elektrischer Strom an das Gel angelegt (die positive Elektrode gegenüber den Vertiefungen). Da die DNA negativ geladen ist, bewegt sie sich durch das Gel in Richtung der positiven Elektrode. Kleinere DNA-Moleküle bewegen sich schneller durch das Gel als größere DNA-Moleküle, was zu einer Größentrennung führt. Nach der Elektrophorese wird die DNA sichtbar gemacht und erscheint als Bande unter jeder Vertiefung. Nur eine große Menge an DNA (Millionen von Kopien) kann sichtbar gemacht werden. Eine „DNA-Leiter“, die eine Mischung von DNA-Fragmenten bekannter Größe enthält, wird ebenfalls auf das Gel geladen. Die Größen der DNA-Proben können dann durch Vergleich mit der DNA-Leiter geschätzt werden (Abbildung 1).
Abbildung 1: Fragmente unterschiedlicher Länge aus einer PCR-Reaktion werden auf ein Gel gegeben. Die Fragmente bewegen sich mit einer Geschwindigkeit und über eine Distanz, die von ihrer Größe abhängt: kleinere DNA-Moleküle bewegen sich schneller und weiter auf dem Gel als längere DNA-Moleküle.
Durch das Mischen des PCR-Produkts mit Ladepuffer können wir sichtbar machen, wie weit das PCR-Produkt während der Gelelektrophorese gewandert ist. Der Ladepuffer ist auch nützlich, um die Probe schwerer zu machen, so dass die Probe beim Pipettieren auf das Gel auf den Boden des Gels sinkt.
Es gibt viele Zusammensetzungen für den Ladepuffer; er enthält jedoch in der Regel Folgendes:
- Färbereagenz, z. B. Xylencyanol, Kresolrot, Bromphenolblau oder Orange G.
Dadurch wird die Probe eingefärbt und die Position der Probe auf dem Agarosegel sichtbar gemacht.
- Reagenz mit hoher Viskosität, z. B. Ficoll, Saccharose oder Glycerin.
Dadurch wird die Probe schwerer, da sich die Gesamtviskosität der Probe erhöht.
- Wasser zum Verdünnen der oben genannten Reagenzien.
Plasmid
Ungeschnittene Plasmide haben fünf Konformationen: eingekerbt, linear, kovalent gebunden, superspiralisiert und zirkulär einzelsträngig. Ein superspiralisiertes Plasmid bewegt sich schneller, da es weniger Reibung an der Agarosematrix hat als ein eingekerbtes oder lineares Plasmid.
Gel-Extraktion
Die Gel-Extraktion wird durchgeführt, um das gewünschte DNA-Fragment aus einem Agarosegel zu gewinnen. Der erste Schritt besteht darin, das Agarosegel mit dem DNA-Fragment der gewünschten Größe herauszuschneiden. Das Gel wird dann in eine Reinigungssäule mit einer Silikamembran gegeben. Dann wird ein Bindungspuffer mit einem chaotropen Mittel zugegeben, um das Agarosegel aufzulösen, das Protein zu denaturieren und die DNA-Bindung an die Kieselmembran zu fördern. Um den Auflösungsprozess des Gels zu beschleunigen, wird das Gemisch bei 55-60oC inkubiert. Andere verbleibende Reste werden mit dem Waschpuffer entfernt. Der letzte Schritt ist die Zugabe des Elutionspuffers, um die gereinigte DNA von der Reinigungssäule zu eluieren.