Gibson-Assembly

Das Gibson-Assembly ist eine Klonierungstechnik, die nicht wie herkömmliche Klonierungsverfahren auf Restriktionsstellen angewiesen ist. Das Gibson-Assembly beruht auf dem Vorhandensein homologer Regionen an den Enden der DNA-Stücke.

Die drei Enzyme T5-Exonuklease, Phusion-DNA-Polymerase und Taq-DNA-Ligase bearbeiten alle unterschiedliche Teile der DNA-Enden. Zunächst schneidet die T5-Exonuklease die 5er-Enden ab und erzeugt so einzelsträngige komplementäre Überhänge zwischen den beiden Einschüben. Diese Überhänge verbinden sich, und die Phusion-Polymerase fügt die fehlenden Nukleotide zwischen die Sequenz der doppelsträngigen DNA ein, wobei der homologe Überhang als Priming-Sequenz verwendet wird. Einmal in Gang gesetzt, ist die Phusionsreaktion viel schneller als die langsame Nuklease und die Lücken werden rasch gefüllt. Im letzten Schritt schließt die Ligase den Strangbruch und verschmilzt die beiden DNA-Fragmente miteinander. Alle diese Enzyme sind bei 50 ºC aktiv. Daher können mehrere DNA-Stücke in einem einzigen Röhrchen zusammengefügt werden.

Das Gibson-Assembly wird verwendet, um große Schaltkreise aus Positions-Vektoren zu konstruieren.

Lies mehr darüber wie man eine Gibson-Reaktion aufbaut