Gibson Assembly Vorbereitung

Für die Gibson Assembly brauchst du DNA-Fragmente mit überlappenden Enden. Diese Fragmente werden oft durch einen Restriktionsverdau mit den passenden Restriktionsenzymen erhalten.

Um eine hohe Ausbeute des Gibson-Produkts zu erhalten, sollte die gleiche Anzahl von jedem DNA-Fragment zum Reaktionsgemisch hinzugefügt werden. In den meisten Fällen sind die Fragmente unterschiedlich lang, daher musst du die äquimolare Konzentration mit der folgenden Formel berechnen:

Die Konzentration der verschiedenen DNA-Fragmente kann mit dem Nanodrop gemessen werden, einem Gerät, mit dem die Konzentration von Nukleinsäuren in einer minimalen Menge an Flüssigkeit gemessen werden kann. Die Länge der Fragmente kann aus den Plasmid Karten bestimmt werden. Sobald du die benötigte Menge der einzelnen Fragmente berechnet hast, musst du Wasser bis zum vorgegebenen Reaktionsvolumen hinzufügen. Um die Reaktion zu starten, musst du nur das gleiche Volumen der 2X Gibson-Reaktionsmischung hinzufügen und die Probe eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius inkubieren.