Ligation
Die Ligation, ein Prozess, bei dem das Phosphatgerüst der doppelsträngigen DNA kovalent miteinander verbunden wird, wird von einem Enzym namens DNA-Ligase durchgeführt. Die DNA-Ligase, die häufig in biotechnologischen Labors verwendet wird, wurde aus dem Phagen T4 oder aus E.coli isoliert. Beide katalysieren Ligationsreaktionen in ähnlicher Weise, unterscheiden sich aber in ihrem Bedarf an Cofaktoren. Das E.coli-Enzym benötigt NAD+, während das T4-Enzym ATP benötigt. Diese Cofaktoren werden im Puffer bereitgestellt.
Ligationsreaktion
Die Ligationsreaktion besteht im Allgemeinen aus zwei Schritten:
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Kollision der DNA-Enden. Diese Kollision erfolgt zufällig, und die Häufigkeit ist bei niedrigen Temperaturen geringer. Die niedrige Temperatur stabilisiert die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Nukleotiden. Die DNA-Ligase erreicht ihr Aktivitätsoptimum bei 25° C. Als allgemeine Regel gilt: Je niedriger die Inkubationstemperatur, desto länger die Inkubationszeit.
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Enzymatische Reaktion. Die DNA-Ligase katalysiert die Verbindung zwischen 3'-Hydroxyl und 5'-Phosphat.
Ligationsreaktion. Das AMP-Nukleotid wird auf das 5'-Phosphat übertragen. Dann wird die AMP-Phosphat-Bindung von 3'-OH angegriffen, wodurch eine kovalente Bindung entsteht und AMP freigesetzt wird.
Die Effizienz einer Ligationsreaktion kann durch Optimierung des Verhältnisses von Insert zu Vektor erhöht werden. Ein Verhältnis von 3:1 ist ein guter Anfangsparameter. Die Konzentration von DNA-Vektor und Insert kann mit einem Spektralphotometer wie Nanodrop gemessen werden. Die Formel zur Berechnung der Menge des Gens von Interesse (Insert), das in die Ligationsreaktion eingebracht werden muss, lautet:
Beispiel für die Berechnung der Optimierung der Ligationsreaktion:
Daten
Die Ergebnisse der Spektophometermessung sind:
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DNA-Vektor-Konzentration: 30 ng/μl.
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Insert-Konzentration: 15 ng/µl.
Wir haben auch die Daten über die Vektor- und Insertlänge, die 4000 bp bzw. 1000 bp betragen. Das optimale Verhältnis ist 3:1. Wir werden 60 ng DNA-Vektor verwenden.
Berechnung
(ng Vektor x kb Größe des Inserts)/ kb Größe des Vektors x Insert/Vektor = ng des Inserts
- (60ng x 1 kb) / 4 kb x 3/1 = 45 ng des Inserts
| Reaktionskomponente | Reaktionskonzentration | Volumen | ||
|---|---|---|---|---|
| 10x Ligationspuffer, T4-DNA-Ligase | 1X | 20 μl/ 10x = 2μl | ||
| DNA-Vektor | 60ng | 60ng/30ng/μl= 2μl Insert | ||
| T4-DNA-Ligase | 1 Einheit | 1 μl | ||
| Gesamt | 20 μl |
Plasmid-Vektor
Ein Expressionsvektor enthält mehrere Klonierungsstellen, einen selektierbaren Marker, einen Replikationsursprung, einen Operator und einen starken Promotor.
Plasmide sind extrachromosomale DNA-Moleküle, meist doppelsträngig, kovalent geschlossen und zirkulär. Ihre Größe variiert zwischen 1 kb und mehr als 200 kb. Nicht alle Plasmide sind ein Vektor. Ein DNA-Molekül wie ein Plasmid muss bestimmte Eigenschaften aufweisen, damit es als Vektor für die Genklonierung dienen kann. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Vektoren, die auf ihrer Anwendung basieren: Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren. Beide Vektoren haben die wichtigsten Eigenschaften, die ein Vektor haben sollte: ein selektierbares Markergen, einen Replikationsursprung und mehrere Klonierungsstellen. Aber die Expressionsvektoren haben ein zusätzliches Merkmal, nämlich einen starken Promotor, da dieser zur zur Expression von Fremdproteinen, die in dem betreffenden Gen kodiert sind, verwendet wird. Expressionsvektoren können einen Operator als Regulator der Genexpression enthalten. Ein Operator ist ein DNA-Abschnitt, an den sich ein Transkriptionsfaktor bindet. Klonierungsvektoren werden hauptsächlich dazu verwendet, das gewünschte Gen zu übertragen und zu vermehren.
Ein selektierbarer Marker wird verwendet, um sicherzustellen, dass der Wirtsvektor das bestimmte Plasmid beibehält. Ein Replikationsursprung verleiht dem Plasmid die Fähigkeit, sich in der Zelle unabhängig vom Hauptchromosom des Wirts zu vermehren.
Plasmid Zusammenbau
Der Zusammenbau von Plasmiden umfasst im Prinzip die folgenden Schritte:
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Das geschlossene zirkuläre Vektorplasmid und das Fragment des interessierenden Gens werden mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen gespalten.
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Das Gen von Interesse wird an das linearisierte Vektorplasmid ligiert.
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Das resultierende Plasmid wird in einen geeigneten Wirt transformiert.
Verschiedene Restriktionsenzyme können kompatible Überhänge erzeugen. 
Die Erfolgsquote beim Zusammenbau von Plasmiden ist höher, wenn DNA-Fragmente mit 5'- oder 3'-klebrigen/überhängenden Enden verwendet werden, verglichen mit dem Zusammenbau von Plasmiden mit DNA-Fragmenten mit stumpfem Ende. Die DNA-Ligase verbindet zwei DNA-Fragmente mit kompatiblem Überhang. Ein DNA-Fragment mit einem bestimmten Überhang kann nicht nur mit dem Fragment ligiert werden, das mit demselben Restriktionsenzym geschnitten wurde, sondern auch mit einem beliebigen Fragment mit kompatiblen Enden, das von anderen Restriktionsenzymen erzeugt wurde.
Die Bestätigung des Zusammenbaus des Plasmids kann durch die Durchführung einer DNA-Sequenzierung erfolgen. Es ist wichtig zu bestätigen, dass das Insert erfolgreich in den Plasmidvektor mit der richtigen Konformation und dem richtigen Leseraster ligiert wurde. Ein Frame-Shift kann eine Nonsense- oder Misense-Mutation verursachen, die zur Expression eines nicht funktionsfähigen Proteins führt.