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Mastermix

Für ein Experiment mit 7 Röhrchen und 5 Reagenzien (von denen 4 in der gleichen Konzentration benötigt werden) ist die Anzahl der erforderlichen Pipettenbewegungen angegeben. Die Abbildung unten zeigt die Anzahl der erforderlichen Pipettenbewegungen ohne die Verwendung eines Mastermixes. Für dasselbe Experiment wird nun ein Mastermix verwendet. Beachte den Rückgang der Anzahl der Pipettenbewegungen: Stell dir noch größere Experimente vor und den Unterschied in Zeit und Arbeitsaufwand, der dadurch erreicht wird.

Eine Illustration der Gesamtzahl der erforderlichen Pipettenbewegungen während eines Experiments mit und ohne Verwendung eines Mastermixes. Dargestellt sind 7 leere Röhrchen und 5 Röhrchen mit verschiedenen Reagenzien. Die Reagenzien sind in verschiedenen Farben dargestellt. Von links nach rechts sind die Reagenzien gelb, rot, grün und blau gefärbt. Ein fünftes Röhrchen, das ebenfalls ein Reagenz enthält, ist mit der Farbe Grau markiert. Farbige Linien, die den Farben der Reagenzien entsprechen, führen von den Reagenzienröhrchen zu den leeren Probenröhrchen und veranschaulichen so, wie jedes Reagenz in jedes Probenröhrchen gegeben wird. Das gelbe, rote, grüne und blaue Reagenz wird jeweils in der gleichen Konzentration zugegeben. Das graue Reagenz wird in unterschiedlichen Konzentrationen in die leeren Röhrchen gegeben. Jede Linie kann als eine Pipettenbewegung gezählt werden, und die Gesamtzahl der Pipettenbewegungen, die für das Experiment ohne Mastermix erforderlich sind, beträgt 35. Unter der Abbildung befindet sich eine weitere Abbildung desselben Versuchsaufbaus, aber in diesem Fall mit der Verwendung eines Mastermixes. Ein weiteres Probenröhrchen mit dem blau dargestellten Mastermix wird dem Versuchsaufbau hinzugefügt und die farbigen Linien von den 4 Reagenzröhrchen, die gelb, rot, grün und blau dargestellt sind, führen nun von den Reagenzröhrchen zum Mastermixröhrchen, was zu weniger Pipettierbewegungen führt. Sonstige Linien, die ebenfalls die Pipettenbewegungen veranschaulichen, führen nun vom Mastermix-Röhrchen und dem grauen Reagenzienröhrchen zu den 7 leeren Probenröhrchen. Alle Pipettenbewegungen, von den Reagenzien zum Mastermix und vom Mastermix zu den leeren Röhrchen, führen zu einer deutlich geringeren Anzahl an erforderlichen Pipettenbewegungen, die jetzt nur noch 18 beträgt

Abbildung 1: Zwei Versuchsaufbauten mit 7 Röhrchen und 5 Reagenzien (von denen 4 in der gleichen Konzentration benötigt werden). Dargestellt ist die Anzahl der erforderlichen Pipettierbewegungen. Diese Abbildung zeigt die Anzahl der erforderlichen Pipettierbewegungen mit und ohne Verwendung eines Mastermixes.

Wenn du ein Experiment mit einer großen Anzahl ähnlicher Proben durchführst, ist es üblich, einen Mastermix zu erstellen, um die Arbeit im Labor zu erleichtern. Wenn alle deine Proben eine ähnliche Reagenzienmischung haben und nur 1 Reagenz von Probe zu Probe variiert, kannst du einen Mastermix mit allen gängigen Reagenzien vorbereiten (das geht natürlich nur, wenn alle Reagenzien in den gleichen Konzentrationen benötigt werden). Jetzt kannst du beim Ansetzen deiner Proben aus dem Mastermix pipettieren und dann dein variables Reagenz hinzufügen, anstatt z. B. 4 verschiedene Reagenzien in der richtigen Menge in jedes einzelne Röhrchen zu mischen. Das Konzept ist in der Abbildung oben dargestellt.

In diesem Fall der Enzymkinetik kann bei einer bestimmten Substratkonzentration ein Mastermix hergestellt werden, der NAD+, Ethanol und Puffer enthält. Wenn das Enzym zugegeben wird, beginnt die Reaktion, und das Enzym ist daher nicht im Mastermix enthalten. In diesem Fall ist die Verwendung eines Mastermixes nicht zwingend notwendig, aber für viele Anwendungen ist diese Fähigkeit unerlässlich und bei Enzymkinetik-Tests im Allgemeinen sehr nützlich.

Berechnung der Substratkonzentrationen

Im Experiment musst du berechnen, wie viel Substrat du in ein Röhrchen geben musst, um die gewünschte Substratkonzentration zu erhalten. Dies kannst du mit der folgenden Formel tun:

C1 · V1 = C2 · V2

wobei C = Konzentration und V = Volumen. Denke daran, auf beiden Seiten des Gleichheitszeichens die gleichen Einheiten zu verwenden!

Beispiel: Wir haben eine Stammlösung des Substrats von 1 M und brauchen eine Endkonzentration von 200 mM in einem Volumen von 500 μl. Welches Volumen der Stammlösung müssen wir hinzufügen, um die gewünschte Konzentration zu erreichen?

Wenn die Ausgangskonzentration C1 ist, ist C2 die gewünschte Endkonzentration Konzentration und V2 ist das Endvolumen. Damit ist V1 das unbekannte Element. Wir können nun V1 isolieren, die bekannten Werte einsetzen und das Volumen berechnen:

Isolieren: V1 = (C2 · V2)/C1

Einsetzen und berechnen: V1 = (0,2 M · 0,0005l) / 1 M = 0,0001 L = 100 μl

Theorie-Übersicht