Schmelzkurve

Die Schmelzkurvenanalyse wird zur Beurteilung der Spezifität des qPCR-Assays bei Verwendung von Farbstoffen wie SYBR^®Green verwendet.

Die Schmelzkurvenanalyse besteht aus einem zusätzlichen Schritt am Ende des qPCR-Laufs. Die Temperatur der Probe wird schrittweise erhöht, während das Gerät weiterhin die Fluoreszenz misst. Mit steigender Temperatur denaturiert die doppelsträngige DNA und wird einzelsträngig, und der Farbstoff dissoziiert, was zu einer abnehmenden Fluoreszenz führt. Die Änderung der Steigung dieser Kurve wird dann als Funktion der Temperatur aufgetragen, um die Schmelzkurve zu erhalten. Die Schmelztemperatur des Amplikons wird durch die Länge der Sequenz und ihre Basenzusammensetzung bestimmt. Ein spezifischer Assay sollte im Optimalfall einen einzigen Schmelz-Spitzenwert zeigen, der einem einzigen spezifischen PCR-Produkt entspricht (siehe Abbildung 1). Anhand der Schmelzkurvenanalyse lässt sich feststellen, ob in deiner qPCR ein Primer-Dimer vorhanden ist, wie der Spitzenwert auf der linken Seite der Hauptamplikon-Spitze in Abbildung 2 zeigt. Eine Spitze nach der Hauptspitze, die ebenfalls in Abbildung 2 zu sehen ist, könnte auf eine unspezifische Amplifikation hinweisen (z. B. wenn die genomische Sequenz dieses Gens ein Intron enthält oder ein ähnliches Gen, das zur gleichen Genfamilie gehört, usw.).

Abbildung 1: Ideale Schmelzkurve

Abbildung 2: Schmelzkurve mit Primer-Dimer und Kontamination mit einem längeren DNA-Fragment.

Die Schmelzkurvenanalyse ist eine wichtige Überprüfung für die Analyse der qPCR-Daten.