Next Generation Sequencing
Next Generation Sequencing
Next Generation Sequencing bzw. Sequenzierung der nächsten Generation ist eine fortschrittliche Sequenzierungsmethode, bei der viele kurze DNA-Moleküle zur gleichen Zeit sequenziert werden. Diese Methode wird auch als massives paralleles Sequenzieren bezeichnet. Diese kurzen DNA-Moleküle werden anschließend zusammengesetzt, indem ihre Sequenz mit einer Referenzsequenz verglichen wird, wodurch die vollständige DNA-Sequenz enthüllt wird, die sehr lang sein kann (so lang wie unser Genom!).
Es gibt viele verschiedene Plattformen für das Next Generation Sequencing, und jede von ihnen verwendet eine andere Technik für die DNA-Sequenzierung. In unserem Fall konzentrieren wir uns auf die vom Us-amerikanischen Hersteller Illumina verwendete reversible Farbstoff-Terminator-Methode bzw. Illumina-Sequenzierung. Bei dieser Methode wird die DNA zunächst in kleinere Stücke zerlegt, und zwei kurze DNA-Moleküle, sogenannte „Adapter“, werden an jedes Ende der Probe ligiert (siehe Abbildung 1). Diese Adapter fungieren als Primer-Andockstellen für die Amplifizierung der DNA während der PCR und für die Bindung an die Durchflusszelle. Vor der Analyse der Daten entfernen wir die Adapter, da sie keine biologische Sequenzen sind.
Die mit Adapter- und Primer-Kappen versehenen DNA-Moleküle werden zunächst auf einen Objektträger (die sogenannte Durchflusszelle) aufgebracht und mit dem Polymeraseenzym amplifiziert, wodurch lokale klonale DNA-Kolonien entstehen. Diese DNA-Kolonien werden auch als DNA-Cluster bezeichnet. Jeder dieser Cluster enthält die gleiche DNA-Sequenz, daher der Begriff „klonale DNA-Kolonien“. Ähnlich wie bei der First Generation Sequencing-Technik werden die Nukleotide einzeln mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Nach der Zugabe eines Nukleotids stoppt die Elongation, und es wird ein Bild aufgenommen. Anschließend wird der am 3'-Ende sitzende Blocker chemisch von der DNA entfernt, so dass der nächste Zyklus der Nukleotidzugabe beginnen kann.
Sobald die DNA extrahiert ist, muss sie zur Vorbereitung auf die Sequenzierung aufbereitet werden. Die verschiedenen Schritte der Probenvorbereitung sind im Folgenden beschrieben:
Auf diese Schritte folgen die Clusterbildung und der eigentliche Sequenzierungsprozess.
Abbildung 1. Arbeitsablauf des Next Generation Sequencing mithilfe der Illumina-Plattform.
Die parallele Sequenzierung erzeugt Milliarden von Messungen (Reads) pro Durchlauf. Dies ist exponentiell größer als die Anzahl der Reads, die beim First Generation Sequencing pro Durchlauf erzeugt werden. Next Generation Sequencing ist eine robuste Sequenzierungsmethode, die für viele verschiedene Anwendungen eingesetzt werden kann, z. B. für das SNP-Profiling, die Genexpressionsanalyse, den Nachweis genetischer Aberrationen wie z. B. Mutationen oder chromosomale Rearrangements.
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