Next-Generation-Sequencing-Experiment
Es gibt verschiedene Plattformen des Next Generation Sequencing und jede von ihnen nutzt eine andere Technik zur Durchführung der DNA-Sequenzierung. In diesem Fall werden wir uns auf die reversible Farbstoffterminierungstechnologie konzentrieren, die von Illumina verwendet wird: Sequenzierung durch Synthese. Dies bedeutet, dass die Sequenzierdaten durch die Synthese jedes Basenpaares gewonnen werden.
Nach der Clusterbildung sind wir bereit, den Sequenzierprozess zu beginnen. Lass uns den Prozess im Detail durchgehen.
Polymerase-Ansatz
Sobald wir den Cluster mit klonaler DNA an die Fließzelle angehängt haben, werden die Sequenzierreagenzien hineingepumpt. Sie treten von einer Seite der Fließzelle ein und auf der anderen Seite wieder aus. Die T4-DNA-Polymerase wird hineingespült und heftet sich an die kurzen DNA-Moleküle, die an die Fließzelle gebunden sind.
Alle 4 Nukleotide sind mit einem spezifischen Fluorophor markiert. In dem Beispiel in Abbildung 1 ist Thymin mit einem grünen Fluorophor, Cytosin mit einem blauen Fluorophor, Guanin mit einem roten Fluorophor und Adenin mit einem orangen Fluorophor markiert.
Diese Nukleotide sind ebenfalls modifiziert: Sie haben eine 3'-Kappe, die nur das Hinzufügen eines Nukleotids auf einmal erlaubt. Daher können, nachdem ein Nukleotid an das 3'-Ende des Primers angefügt wurde, keine weiteren Nukleotide anhängen. Alle verbleibenden frei schwimmenden Nukleotide werden dann aus dem System gewaschen.
Abbildung 1: Sequenzierung durch Synthese. Nachdem die Polymerase an den Primer gebunden hat, werden Nukleotide, die mit einem spezifischen Fluorophor markiert sind, am 3'-Ende des Primers hinzugefügt. Die Nukleotide sind mit einer 3'-Kappe modifiziert, die nur eine Nukleotidanlagerung auf einmal erlaubt. Das vom Fluorophor emittierte Fluoreszenzsignal wird detektiert und die 3'-Kappe wird gespalten, so dass der nächste Sequenzierungszyklus beginnen kann. Nukleotide markiert mit Fluorophor
Detektion
Da alle Nukleotide individuell mit einem spezifischen Fluorophor markiert sind, können wir die Nukleotide durch Beobachtung des Fluoreszenzsignals, das sie aussenden, identifizieren. In Abbildung 1 können wir zum Beispiel sehen, dass ein Nukleotid, das mit einem grünen Fluorophor markiert ist, am 3'-Ende des Primers hinzugefügt wurde. Eine chemische Reaktion löst die Emission des grünen Lichts aus, das durch ein Foto aufgezeichnet werden kann. Da wir wissen, dass Thymine mit dem grünen Fluorophor markiert ist, können wir die Base als Thymine identifizieren. Am Ende eines jeden Zyklus werden vier Bilder gemacht, die jede der möglichen Farben aufzeichnen. Nachdem alle vier Bilder aufgenommen wurden, wird das System sie überlagern. Daher können wir die Basenidentität eines jeden Clusters leicht identifizieren (siehe Abbildung 2).
Abbildung 2: Ein Overlay-Bild, jeder Farbpunkt repräsentiert einen klonal amplifizierten DNA-Cluster. Die Farbcodes für die vier verschiedenen Nukleotide: Thymin, Cytosin, Guanin und Adenin.
Aufspaltung und Entfernung
Nach der Aufnahme wird die 3'-Kappe des Nukleotids abgespalten, damit der nächste Sequenzierzyklus beginnen kann. Dies markiert das Ende eines Sequenzierungszyklus, und der neue Zyklus kann beginnen, indem erneut fluoreszierende Nukleotide injiziert werden und die einzelnen Schritte wiederholt werden.
Nach der Sequenzierung werden die Bilder in einen Computer eingespeist und die Sequenzierungsdaten können mit einer speziellen Software analysiert werden.