NGS Vorbereitung

Ähnlich wie bei der First-Generation-Sequencing-Technik, werden bei der Illumina Sequenzierung, die auf Sequenzierung durch Synthese basiert, die Nukleotide einzeln mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert.

• Ein fluoreszierendes Nukleotid wird hinzugefügt, komplementär zu der zu identifizierenden DNA-Sequenz, und die Elongation stoppt aufgrund eines Blockers an seinem 3'-Ende.
• Es wird ein Bild gemacht, um den Farbstoff/das Nukleotid zu registrieren.
• Der Block, der am 3'-Ende sitzt und die Elongation gestoppt hat, wird chemisch von der DNA entfernt, so dass die nächste Nukleotidaddition fortgesetzt werden kann.

Der Unterschied zum First Generation Sequencing ist, dass die parallele Sequenzierung Millionen von Reads pro Lauf produziert, was sie zu einer viel effizienteren Methode macht.

Um ein NGS Experiment basierend auf Sequenzierung durch Synthese durchzuführen, benötigst du:

• Modifizierte DNA-Probe mit Adaptern
• Modifizierte Nukleotide
• T4-Polymerase
• Next-Generation-Sequencing-Gerät
• Clusterbildung