NGS Sequenzierungsvorgang

Nach der Clusterbildung kann mit der Sequenzierung begonnen werden. Je nach verwendeter Plattform gibt es verschiedene Möglichkeiten zur Durchführung des Next Generation Sequencing. In diesem Labor verwenden wir die Sequenzierung durch Synthese von Illumina. Das bedeutet, dass die Sequenzierungsdaten durch die Synthese jedes Basenpaares gewonnen werden. Im Folgenden wird der Vorgang im Detail beschrieben.

Anbindung der Polymerase

Sobald der DNA-Klon an der Fließzelle befestigt ist, werden die Sequenzierungsreagenzien hineingepumpt. Sie werden von einer Seite der Fließzelle hineingepumpt und kommen auf der anderen Seite wieder heraus. Die T4-DNA-Polymerase wird hineingespült und heftet sich an die kurzen DNA-Moleküle, die an die Fließzelle gebunden sind. Die T4-Polymerase ist so modifiziert, dass sie nur eine Base einbauen kann.

Alle 4 Nukleotide sind mit einem bestimmten Fluorophor markiert. Wie in Abbildung 1 zu sehen, ist Thymin mit einem grünen, Cytosin mit einem blauen, Guanin mit einem roten und Adenin mit einem orangen Fluorophor markiert. Außerdem sind diese Nukleotide modifiziert: Sie verfügen über ein sogenanntes 3'-Ende, das nur den Einbau eines Nukleotids auf einmal erlaubt. Nachdem ein Nukleotid an das 3'-Ende des Primers angefügt wurde, können keine weiteren Nukleotide mehr angefügt werden. Alle verbleibenden frei schwimmenden Nukleotide werden dann aus dem System gewaschen.

Abbildung 1: Sequenzierung durch Synthese. Nachdem sich die Polymerase an den Primer angehängt hat, werden mit einem spezifischen Fluorophor markierte Nukleotide am 3'-Ende des Primers hinzugefügt. Die Nukleotide sind mit einer 3'-Kappe modifiziert, die jeweils nur ein Nukleotid auf einmal zulässt. Das vom Fluorophor abgegebene Fluoreszenzsignal wird erkannt und die 3'-Kappe wird gespalten, sodass der nächste Sequenzierungszyklus beginnen kann.

Mit Fluorophor markierte Nukleotide

Detektion

Da alle Nukleotide mit einem bestimmten Fluorophor markiert sind, können sie durch Beobachtung des Fluoreszenzsignals, das sie aussenden, identifiziert werden. Auf Abbildung 1 sieht man zum Beispiel, dass ein mit grünem Fluorophor markiertes Nukleotid am 3'-Ende des Primers hinzugefügt wurde. Eine chemische Reaktion löst die Emission des grünen Lichts aus, das auf einem Foto festgehalten werden kann. Da man weiß, dass Thymin mit dem grünen Fluorophor markiert ist, kann man die Base als Thymin identifizieren. Am Ende eines jeden Zyklus werden vier Bilder gemacht, die jede der möglichen Farben aufzeichnen. Nachdem alle vier Bilder aufgenommen wurden, überlagert das System sie. So kann die Identität der Basen in den einzelnen Clustern leicht festgestellt werden (siehe Abbildung 2).

Abbildung 2: Ein überlagertes Bild. Jeder Farbpunkt steht für einen klonal amplifizierten DNA-Cluster. Die Farbcodes stehen für die vier verschiedenen Nukleotide: Thymin, Cytosin, Guanin und Adenin.

Spaltung und Beseitigung

Nach der Aufnahme wird die 3'-Kappe des Nukleotids abgespalten, damit der nächste Sequenzierungszyklus beginnen kann. Die abgespaltene 3'-Kappe wird dann aus dem System entfernt. Damit ist ein Sequenzierungszyklus beendet, und der neue Zyklus kann beginnen, indem neue Nukleotide eingespült werden und die Schritte wiederholt werden.

Nach der Sequenzierung werden die Bilder in einen Computer eingegeben und die Sequenzierungsdaten mit einer speziellen Software analysiert.