PCR-Amplifikation

PCR (Polymerase Kettenreaktion)

PCR ist eine Methode, um Milliarden von Kopien bestimmter DNA-Sequenzen herzustellen. Es ist oft notwendig, eine größere Anzahl von Kopien der spezifischen DNA-Sequenz zu haben als die, die in einer typischen Probe gefunden wird, um die DNA auf ihre Basenpaar-Sequenz oder Länge zu analysieren. Darüber hinaus ist die PCR-Reaktion hochspezifisch, was bedeutet, dass sie nur Kopien einer gewünschten Sequenz aus der Template-DNA (Probe) herstellt. Diese Spezifität wird durch die Primer gewährleistet, die so konzipiert sind, dass sie komplementär sind und sich an spezifische Regionen auf jeder Seite der DNA-Region von Interesse (Zielregion) anlagern. Diese Eigenschaften machen die PCR zu einer leistungsstarken Technik, die zum Beispiel bei der Genotypisierung von Markern, vor der Sequenzierung oder bei verschiedenen DNA-Tests.

Abbildung 1. Die PCR besteht aus drei Schritten: 1. Denaturierung, 2. Annealing, und 3. Verlängerung. Die Schritte werden viele Male wiederholt (oft 30), wodurch Milliarden von DNA-Kopien von bestimmten Regionen entstehen

PCR Schritte

Um Milliarden von DNA-Kopien herzustellen, werden viele wiederholte Zyklen der DNA-Synthese in einem PCR-Röhrchen durchgeführt. Jeder Zyklus beinhaltet drei verschiedene Schritte, die durch die Temperatur definiert sind (Abbildung 1). Alle Zyklen werden ohne Eingriff in einer PCR-Maschine durchgeführt, die die Temperatur nach jedem Schritt automatisch ändern kann.

1. Denaturierungsschritt (95ºC): Bei dieser hohen Temperatur werden die Wasserstoffbrücken, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, gebrochen, und die DNA-Stränge fallen auseinander. Die einzelsträngige DNA ist nun für das Kopieren verfügbar.
2. Annealing-Schritt (5-10ºC unter dem Primer mit der niedrigeren Tm): Bei der Annealing-Temperatur binden kurze DNA-Stücke, Primer genannt, an komplementäre Stellen der Template-DNA. Die Primer definieren die Zielsequenz, d.h. die spezifische Region der DNA, die kopiert werden soll. Die Annealing-Temperatur wird aus der Primer-Zusammensetzung (die Anzahl der Nukleotide sowie die Anzahl von Guanin und Cytosin) berechnet. Normalerweise müsstest du die optimale Annealing-Temperatur für jeden Primer berechnen. In diesem Fall betrachten wir 54°C als Annealing-Temperatur für alle Primer.
3. Erweiterungsschritt (72ºC): Bei 72 ºC ist ein Enzym namens DNA-Polymerase für das Kopieren der DNA verantwortlich. Es erkennt das 3′-Ende eines Primers, der an einen Template-Strang gebunden ist, und beginnt, die Template-DNA zu kopieren. In diesem Fall handelt es sich um eine thermostabile Polymerase, da sie bei der verwendeten hohen Temperatur aktiv sein muss.

Am Ende eines Zyklus sind Teile der ursprünglichen DNA-Stränge verdoppelt worden. Am Ende von z.B. 30 Zyklen, die üblicherweise bei der PCR durchgeführt werden, befinden sich mindestens 1 Milliarde (2³⁰) Kopien der Zielsequenz im Röhrchen.

PCR-Reagenzien

Mehrere Reagenzien werden benötigt, um ein PCR-Experiment durchzuführen:

• Primere: Primer binden an eine bestimmte DNA-Sequenz und markieren den Beginn der DNA-Amplifikation.
• Nukleotide: Nukleotide werden benötigt, um die neue DNA-Sequenz aufzubauen.
• Polymerase: Die Polymerase ist ein Enzym, das die Nukleotide auf der Basis der Template-Sequenz zusammensetzt.
• Template-DNA: Eine Vorlage wird benötigt, um die Basis für die Vervielfältigung der neuen DNA-Sequenz zu sein.

Wenn du ein PCR-Experiment vorbereitest, musst du besonders vorsichtig sein, um mögliche Verunreinigungen zu vermeiden. PCR ist eine sehr starke Technik, um DNA zu vervielfältigen. Das bedeutet, dass wenn du eine winzige Kontamination hast (zum Beispiel DNA die von anderen Proben stammt), kann diese DNA ebenfalls vervielfältigt werden, mit der ursprünglichen Vorlage konkurrieren und die Ergebnisse deines Experiments zerstören. Um Kontaminationen zu vermeiden, musst du immer Handschuhe tragen und in einer sehr sauberen Umgebung arbeiten (z.B. wechsle die Pipettenspitzen, wenn du aus einem anderen Behälter pipettierst, binde deine Haare zusammen oder huste oder niese nicht in der Nähe der PCR Werkbank).