PCR-Experiment

Um Millionen von DNA-Kopien zu erstellen, erfolgen in einem PCR-Röhrchen viele Zyklen der DNA-Synthese. Jeder Zyklus besteht aus drei verschiedenen Schritten, die jeweils durch die Temperatur reguliert werden (siehe Abbildung unten):

1. Denaturierung (95 ºC): Bei dieser hohen Temperatur werden die Wasserstoffbindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, aufgebrochen und die DNA-Stränge liegen als Einzelstränge vor. Die einzelsträngige Matrize ist nun bereit, kopiert zu werden.

2. Anlagerung (5-10 ºC unter dem Primer mit der niedrigsten Tm): Bei der Anlagerung binden kurze DNA-Stücke, die sogenannten Primer, komplementär an die Matrizen-DNA. Die Primer definieren die Zielsequenz, die spezifische DNA-Region, die kopiert werden soll. Die Anlagerungs-Temperatur wird anhand der Zusammensetzung der Primer berechnet (die Anzahl der Nukleotide und die Anzahl der Basen Guanin und Cytosin spielen hier eine Rolle). Normalerweise würde man die optimale Anlagerungs-Temperatur für jeden Primer einzeln berechnen müssen.

3. Elongation (72 ºC): Bei 72 ºC ist ein Enzym, die DNA-Polymerase, zuständig für das Kopieren der DNA. Es erkennt das 3′ Ende eines Primers, der an den Matrizen-Strang gebunden hat und beginnt damit, die Matrizen-DNA zu kopieren. In diesem Fall handelt es sich um eine hitzestabile Polymerase, da sie bei den hohen Temperaturen der PCR-Reaktion aktiv sein muss.

Alle Zyklen laufen ohne Unterbrechung in einem PCR-Gerät ab, das die Temperatur automatisch nach jedem Schritt verändert. Am Ende des ersten Zyklus wurden Teile der Ausgangs-DNA verdoppelt. Am Ende des 30ten Zyklus z. B., was ungefähr der Anzahl der Zyklen eines PCR-Experiments entspricht, befinden sich mindestens 1 Milliarde (2³⁰) Kopien der Target-Sequenz im PCR-Röhrchen.

PCR-Experiment: Die PCR-Reaktion besteht aus drei Schritten: 1. Denaturierung, 2. Annlagerung und 3. Elongation. Die Schritte werden viele Male wiederholt (oft bis zu 30 Mal), um Milliarden von DNA-Kopien einer spezifischen Region herzustellen.