PCR-Amplifikation

Die PCR ist eine Methode zur Herstellung von Milliarden von Kopien bestimmter DNA-Sequenzen.

Für die Analyse der DNA-Sequenz oder -Länge wird in der Regel eine größere Anzahl von Kopien dieser spezifischen DNA-Sequenz benötigt, als in einer typischen Probe vorhanden ist. Darüber hinaus ist die PCR-Reaktion hochspezifisch, d. h. es werden nur Kopien der gewünschten Sequenz aus der DNA-Matrize (DNA-Probe) hergestellt. Diese Spezifität wird durch die Primer gewährleistet, die so konzipiert sind, dass sie komplementär sind und sich an spezifische Regionen auf jeder Seite der gewünschten DNA-Region (Zielregion) anlagern. Diese Eigenschaften machen die PCR zu einer leistungsstarken Methode, die zum Beispiel bei der Genotypisierung von Markern, vor der Sequenzierung oder bei verschiedenen DNA-Tests verwendet wird.

Abbildung 1: Die PCR besteht aus drei Schritten: 1. der Denaturierung, 2. der Hybridisierung (Anlahgerung) und 3. der Elongation. Die Schritte werden viele Male wiederholt (oft 30-mal), wodurch Milliarden von DNA-Kopien bestimmter Regionen erzeugt werden.

PCR-Schritte

Um Milliarden von DNA-Kopien herzustellen, werden viele wiederholte Zyklen der DNA-Synthese in einem PCR-Gefäß durchgeführt. Jeder Zyklus umfasst drei verschiedene Schritte, die durch die Temperatur definiert sind (Abbildung 1). Alle Zyklen werden in einem PCR-Gerät durchgeführt, das die Temperatur nach jedem Schritt automatisch ändern kann.

1. Denaturierung (95 ºC): Bei dieser hohen Temperatur werden die Wasserstoffbrücken, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, aufgebrochen und die DNA-Stränge fallen auseinander. Die einzelsträngige DNA ist nun zum Kopieren verfügbar.
2. Hybridisierung (54 ºC): Bei 54 ºC binden sich kurze DNA-Stücke, sogenannte Primer, an komplementäre Stellen der DNA-Matrize. Die Primer definieren die Zielsequenz, d. h. den spezifischen DNA-Bereich, der kopiert werden soll. Die Hybridisierungs-Temperatur wird anhand der Primer-Zusammensetzung (der Anzahl der Nukleotide sowie der Anzahl der Guanine und Cytosine) berechnet. Normalerweise müsstest du die optimale Hybridisierungs-Temperatur für jeden Primer berechnen. In diesem Fall gehen wir von 54 °C als Hybridisierungs-Temperatur für alle Primer aus.
3. Elongation (72 ºC): Bei 72 ºC ist ein Enzym namens DNA-Polymerase für das Kopieren der DNA zuständig. Es erkennt das 3′-Ende eines an einen Matrizenstrang gebundenen Primers und beginnt mit dem Kopieren der DNA-Matrize.

Am Ende eines Zyklus sind Teile der ursprünglichen DNA-Stränge in ihrer Anzahl verdoppelt. Am Ende von z. B. 30 Zyklen, die bei der PCR üblicherweise durchgeführt werden, befinden sich mindestens 1 Milliarde (2³⁰) Kopien der Zielsequenz im Röhrchen. Zur Durchführung der PCR benötigst du eine thermostabile DNA-Polymerase, Nukleotide, Primer und die DNA, die du als Matrize verwenden willst.

PCR-Reagenzien

Für die Durchführung eines PCR-Experiments werden mehrere Reagenzien benötigt;

• Primer: Primer binden an eine bestimmte DNA-Sequenz und markieren den Beginn der DNA-Amplifikation
• Nukleotide: Nukleotide werden benötigt, um die neue DNA-Sequenz aufzubauen
• Polymerase: Die Polymerase ist ein Enzym, das die Nukleotide auf der Grundlage der Matrizen-Sequenz zusammensetzt
• DNA-Matrize: Eine Matrize wird als Grundlage für die Amplifikation der neuen DNA-Sequenz benötigt

Bei der Vorbereitung eines PCR-Experiments musst du besonders vorsichtig sein, um mögliche Verunreinigungen zu vermeiden. Die PCR ist eine sehr leistungsfähige Methode zur Amplifikation von DNA. Das bedeutet, dass bei einer winzigen Verunreinigung (z. B. DNA aus anderen Proben) diese DNA ebenfalls vervielfältigt werden kann und mit der ursprünglichen Matrize konkurriert, wodurch die Ergebnisse deines Experiments unbrauchbar werden. Um Verunreinigungen zu vermeiden, solltest du stes Handschuhe tragen und in einer sehr sauberen Umgebung arbeiten (wechsle die Pipettenspitzen, wenn du aus einem anderen Gefäß pipettierst, binde deine Haare zusammen, huste oder niese nicht in der Nähe der PCR-Werkbank usw.).

Wie oben beschrieben, können Fehler bei einem PCR-Experiment leicht das Ergebnis verfälschen. Deshalb müssen wir die Fehlerwahrscheinlichkeit bei der PCR minimieren, insbesondere wenn wir anschließend eine weitere besonders empfindlichen Technik wie das Next Generation Sequencing (NGS) durchführen. Normalerweise besteht die PCR beim NGS nur aus 10-12 Zyklen. Die bei der PCR auftretenden Fehler zeigen sich beim Abgleich der NGS-Daten als Mismatches, das gilt besonders für Fehler in früheren PCR-Durchläufen, die sich in mehreren Messergebnissen (Reads) zeigen und fälschlicherweise eine genetische Variation in der Probe vermuten lassen.