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PCR (Polymerase-Kettenreaktion)

PCR ist eine Methode zur Herstellung von Milliarden von Kopien bestimmter DNA-Sequenzen. Oft ist eine größere Anzahl von Kopien der spezifischen DNA-Sequenz erforderlich, als sie in einer typischen Probe zu finden ist, um die DNA auf ihre Basenpaarfolge oder Länge zu analysieren. Darüber hinaus ist die PCR-Reaktion hochspezifisch, d. h. es werden nur Kopien einer gewünschten Sequenz aus der Vorlagen-DNA (Probe) hergestellt. Diese Besonderheit wird durch die Primer gewährleistet, die komplementär sind und sich an spezifische Regionen auf jeder Seite der zu untersuchenden DNA-Region (Zielregion) anlagern. Diese Eigenschaften machen die PCR zu einer leistungsstarken Technik, die zum Beispiel bei der Genotypisierung von Markern, vor der Sequenzierung oder bei verschiedenen DNA-Tests eingesetzt werden kann.

Die 3 Schritte der PCR-Reaktion. Schritt 1, die sogenannte Denaturierung, zeigt zwei parallele, horizontal ausgerichtete blaue Pfeile. Der obere Pfeil zeigt nach rechts und ist an seinem linken Ende mit der Primzahl 5 und an seinem rechten Ende mit der Primzahl 3 gekennzeichnet. Der untere Pfeil zeigt nach links und ist an seinem linken Ende mit der Primzahl 3 und an seinem rechten Ende mit der Primzahl 5 gekennzeichnet. Schritt 2, die sogenannte Hybridisierung (Primerhybridisierung), zeigt die gleichen Pfeile, die immer noch parallel und horizontal ausgerichtet sind, nun aber weiter voneinander entfernt. Zwei kleine gelbe Pfeile befinden sich jeweils in der Nähe der 3 Prime Enden und zeigen in die den blauen Pfeilen entgegengesetzte Richtung. Schritt 3, die sogenannte Elongation, zeigt die gleichen Pfeile, aber jetzt werden die gelben durch rote Pfeile ersetzt, die die gleiche Länge haben wie die ursprünglichen blauen. Von hier aus wiederholt sich der Zyklus zwei Mal, wobei Pfeile mit entgegengesetzter Richtung getrennt und neue hybridisiert und elongiert werden, um neue komplementäre Stränge zu bilden.

PCR-Schritte

Um Milliarden von DNA-Kopien herzustellen, werden viele wiederholte Zyklen der DNA-Synthese in einem PCR-Gefäß durchgeführt. Jeder Zyklus umfasst drei verschiedene Schritte, die durch die Temperatur bestimmt werden (Abbildung 1). Alle Zyklen werden ohne Eingriff in einer PCR-Maschine durchgeführt, die automatisch die Temperatur ändern kann, um die Schritte zu erzeugen.

  1. Denaturierung (95ºC): Bei dieser hohen Temperatur werden die Wasserstoffbrücken, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, aufgebrochen, und die DNA-Stränge fallen auseinander. Die einzelsträngige DNA steht nun zum Kopieren zur Verfügung.
  2. Hybridisierung (54ºC): Bei 54 Grad Celsius binden sich kurze DNA-Stücke, Primer genannt, an komplementäre Stellen der Vorlagen-DNA. Die Primer definieren die Zielsequenz, d. h. den spezifischen DNA-Bereich, der kopiert werden soll. Die Hybridisierungstemperatur wird anhand der Primerzusammensetzung (Anzahl der Nukleotide sowie Anzahl der Guanine und Cytosine) berechnet. Normalerweise müsste man die optimale Hybridisierungstemperatur für jeden Primer berechnen. In diesem Fall werden 54 Grad Celsius als Hybridisierungstemperatur angenommen.
  3. Elongation (72ºC): Bei 72ºC ist ein Enzym namens DNA-Polymerase für das Kopieren der DNA verantwortlich. Es erkennt das 3er-Ende eines an einen Vorlagenstrang gebundenen Primers und beginnt mit dem Kopieren der Vorlagen-DNA.

Am Ende eines Zyklus haben sich Teile der ursprünglichen DNA-Stränge in ihrer Anzahl verdoppelt. Am Ende von z. B. 30 Zyklen, die in der Regel bei der PCR durchgeführt werden, befinden sich mindestens 1 Milliarde (230) Kopien der Zielsequenz in dem Gefäß. Um eine PCR durchzuführen, benötigt man eine thermostabile DNA-Polymerase, Nukleotide, Primer und die DNA, die man als Vorlage verwenden möchte.

PCR-Reagenzien

  • Primer: Primer binden an einer bestimmten DNA-Sequenz und markieren den Beginn der DNA-Amplifikation.
  • Nukleotide: Nukleotide werden benötigt, um die neue DNA-Sequenz aufzubauen.
  • Polymerase: Polymerase ist ein Enzym, das die Nukleotide auf der Grundlage der Vorlagensequenz zusammensetzt.
  • Vorlagen-DNA: Als Grundlage für die Amplifikation einer neuen DNA-Sequenz wird eine Vorlage benötigt.

Bei der Vorbereitung eines PCR-Experiments muss man besonders vorsichtig sein, um mögliche Kontaminationen zu vermeiden. PCR ist eine sehr leistungsfähige Technik zur Amplifikation von DNA. Das bedeutet, dass bei einer winzigen Verunreinigung (z. B. DNA aus einer anderen Probe) diese DNA ebenfalls vervielfältigt werden kann, mit der ursprünglichen Vorlage konkurriert und die Versuchsergebnisse zunichte macht. Um eine Kontamination zu vermeiden, muss man immer Handschuhe tragen und in einer sehr sauberen Umgebung arbeiten (die Pipettenspitzen wechseln, wenn man aus einem anderen Behälter pipettiert, die Haare zusammenbinden, nicht in der Nähe der PCR-Werkbank husten oder niesen usw.).

STR-Marker

Gelelektrophorese

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