Die Phenol-Chloroform-Methode zur Isolierung von Nukleinsäuren

Nukleinsäuren aus Zellen können mit der Phenol-Chloroform-Methode isoliert werden. Phenol-Chloroform ist ein Gemisch aus puffergesättigtem Phenol und Chloroform im Verhältnis 1:1. Die Schritte des Verfahrens sind wie folgt:

• 1) Lyse und Homogenisierung in wässriger Lösung. Dies geschieht mit einem Lysispuffer und durch Vortexen der Probe.
• 2) Zugabe von Phenol-Chloroform zum Lysat und Mischen durch Vortexen.

• 3) Zentrifugiere, um die Phasen je nach Dichte zu trennen. Phenol hat eine Dichte von 1,07 g/cm³, während Chloroform eine höhere Dichte hat (1,47 g/cm³), sodass sie zwei Phasen bilden, die untere organische Phase (Phenol-Chloroform) und die obere wässrige Phase (siehe Abbildung unten). Nukleinsäuren erhalten ihre Polarität durch das negativ geladene Phosphatgerüst; daher sind Nukleinsäuren in der oberen wässrigen Phase löslich. Proteine enthalten hydrophobe Bereiche, die mit Phenol in Wechselwirkung treten und dazu führen, dass die Proteine an der Grenzfläche zwischen zwei Phasen ausfallen (oft als weiße Ausflockung). Lipide haben ebenfalls einen hydrophoben Bereich und lösen sich in der unteren organischen Phase auf. Der pH-Wert des Gemischs bestimmt die Trennung der Nukleinsäuren. Bei neutralem pH-Wert werden RNA und DNA in der oberen wässrigen Phase gehalten, bei saurem pH-Wert wandert die DNA in die untere organische Phase und die RNA bleibt in der oberen wässrigen Phase.

• 4) Rückgewinnung der Nukleinsäuren. Im letzten Schritt werden die Nukleinsäuren durch Ausfällung mit Isopropanol aus der wässrigen Phase zurückgewonnen.

Für die Nukleinsäureisolierung wird die Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode verwendet.