Plasmidextraktion mit Miniprep
Es gibt verschiedene Methoden zur Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen. Miniprep ist eine schnelle Isolierungsmethode in kleinem Maßstab, die auf der alkalischen Lyse der Zellen und der anschließenden Reinigung der DNA über eine Silika-Trennsäule beruht.
Die folgenden Schritte müssen durchgeführt werden, um Plasmide aus einer Bakterienkultur aufzureinigen:
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Pelletierung der Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 rpm für 3 min.
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Homogenisierung der Zellen durch Hinzufügen eines Homogenisierungspuffers und mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.
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Lyse der Zellen mit einem Lysepuffer (der ein Detergenz enthält) und durch mehrmaliges Invertieren des Probenröhrchens.
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Lyse der Zellen für maximal 5 min bei Raumtemperatur.
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Stoppen der Reaktion durch Hinzufügen eines Neutralisationspuffers und mehrmaliges Invertieren des Probenröhrchens. Es entstehen weiße Klumpen aus Zellrückständen.
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Pelletierung der Zellrückstände durch Zentrifugation für 10 min bei 13.000 rpm. Am Ende befinden sich die Plasmide im Überstand (der flüssigen Phase).
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Überführung des Überstandes auf die Kieselerde-Trennsäule und Zentrifugation bei 13.000 rpm für 1 min. Dein Plasmid wird an den Filter am Boden der Trennsäule binden. Entsorge den Durchfluss.
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Wasche die DNA zweimal mit einem Waschpuffer (hinzufügen, zentrifugieren, entsorgen).
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1 min zentrifugieren, ohne etwas hinzuzufügen, um die Reste des Puffers zu entfernen.
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Überführe deine Trennsäule in ein 1,5 ml Probenröhrchen und gib Elutionspuffer hinzu (Wasser mit 10 mM Tris_HCl). Lasse den Puffer mehrere Minuten auf deiner Werkbank einwirken, bevor du die Trennsäule erneut zentrifugierst.
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Überprüfung der DNA-Konzentrationen mit dem NanoDrop.