Positionsvektor

Positionsvektoren sind spezielle Zielvektoren, die effizient zur Gibson-Assemblierung großer biologischer Schaltkreise verwendet werden können. Jeder Positionsvektor enthält eine Chromatin-Isolator-Sequenz, eine Gateway-Rekombinationskassette und eine Polyadenylierungssequenz.

Diese DNA-Motive werden von zwei verschiedenen, 40 Basenpaare langen, einzigartigen Nukleotidsequenzen (UNS) flankiert. Die UNSs werden wiederum von zwei I-SceI-Restriktionsstellen flankiert. Diese Anordnung der DNA-Motive ermöglicht den schnellen und reproduzierbaren Aufbau großer biologischer Schaltkreise.

Eingangsvektoren mit Kreislaufteilen können mit der Gateway-Klonierung in den Positionsvektor eingebaut werden. Der SceI-Verdau des resultierenden Plasmids ergibt ein Fragment mit den Schaltkreisteilen und den oben erwähnten DNA-Motiven, flankiert von den beiden UNSs. Diese Fragmente können sofort für die Gibson-Montage verwendet werden. Die Einzigartigkeit der UNSs gewährleistet die spezifische Assemblierung einer großen Anzahl verschiedener Fragmente.

Die folgenden Schritte sind notwendig, um einen großen Stromkreis aus Positionsvektoren zusammenzusetzen:

• Erstelle Eingangsvektoren für alle Schaltkreisteile

• Gateway-Klonierung der Schaltkreisteile in den Positionsvektor

• SceI Verdauung

• Gibson-Assembly der komplementären UNSs