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Protein-Truncation-Experiment

Schematische Darstellung der Schritte eines Protein Truncation Test. Zunächst ist eine doppelsträngige DNA-Helix dargestellt. Die fragliche DNA-Region wird einer PCR-Amplifikation unterzogen, um eine ausreichende Anzahl von Kopien sicherzustellen. Anschließend erfolgen die In-vitro-Transkription und -Translation. Es ist ein RNA-Strang mit einem Startcodon am 3'-Ende zu sehen. Ein Protein, das durch eine Kette roter Punkte dargestellt ist, wird während der Translation zusammengesetzt. Die Proteine werden dann mittels SDS-PAGE analysiert, einem Verfahren, bei dem ein elektrischer Strom in einer Gelmatrix verwendet wird, um Proteine gemäß ihrem Molekulargewicht zu trennen. Es ist ein einfaches Beispiel eines SDS-PAGE-Ergebnisses zu sehen, bei dem Banden in einer Gelkammer die Proteine darstellen. Eine Proteinbande in voller Länge befindet sich in der Nähe der Beladungsgeltasche am oberen Ende der Schale, während sich eine verkürzte Proteinbande in der Kammer weiter nach unten bewegt hat.

Abbildung 1: Ein schematisches Diagramm, das die verschiedenen Schritte des Protein Truncation Test zeigt

Der Protein Truncation Test besteht aus vier Hauptschritten (Abbildung 1):

  1. Nukleinsäureisolierung; entweder genomische DNA, Gesamt-RNA oder poly-A RNA.
  2. Amplifikation einer spezifischen Region des relevanten Gens mittels PCR. In diesem Schritt wird ein Startcodon (ATG) an das 5'-Ende der amplifizierten DNA angehängt.
  3. In-vitro-Transkription und -Translation des Produkts.
  4. Nachweis des translatierten Proteins mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

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