Protein Truncation Test
Abbildung 1: Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte des Protein Truncation Test 
Der Protein Truncation Test ist eine leistungsfähige Methode zur Bewertung von DNA-Mutationen, die in vitro zur Verkürzung von Proteinen führen. Je nach Auswirkung auf die übersetzten Proteine werden DNA-Mutationen in Frameshift-Mutation, Nonsense-Mutation, Missense-Mutation (nicht-synonym), neutrale Mutation und stille Mutation unterteilt. Eine Nonsense-Mutation führt zu einem vorzeitigen Stoppcodon. Dies bedeutet, dass das entstehende Protein früher terminiert wird, als es eigentlich sein sollte, und kann mit einem Protein Truncation Test nachgewiesen werden. Dieses kürzere Protein wird auch als abgeschnittenes Protein bezeichnet. Mit dem Protein Truncation Test müssen wir kein Tier als Modellsystem für die Synthese des Proteins verwenden; stattdessen haben wir ein In-vitro-System, in dem das resultierende Protein synthetisiert werden kann, ohne dass lebende Zellen erforderlich sind.
Proteinkürzungs-Tests werden häufig verwendet, um krankheitsbedingte Mutationen zu analysieren, z. B. bei Krebs, wenn die Mutation zu einem nicht funktionsfähigen Protein führt. Anhand des Protein Truncation Test können wir feststellen, ob in einem bestimmten Teil des Gens eine Mutation vorliegt, die zu einer Proteinverkürzung führt; wir haben jedoch keine Informationen darüber, wo genau sich die Mutation befindet und wie die daraus resultierende DNA-Sequenz aussieht (es könnte sich z. B. um eine Substitution handeln, die ein Stoppcodon erzeugt, oder um eine Deletion, die zu einem Frameshift und dann zu einem Stoppcodon führt, oder andere). Um mehr über die Mutation herauszufinden, müssen wir eine DNA-Sequenzierung als Validierungsmethode durchführen. Mit der DNA-Sequenzierung können wir die genaue DNA-Sequenz ermitteln, die zu einem verkürzten Protein führt.
Der Protein Truncation Test erfolt in vier Hauptschritten (Abbildung 1):
- Nukleinsäureisolierung; entweder genomische DNA, Gesamt-RNA, oder poly-A-RNA.
- Amplifikation einer spezifischen Region des interessierenden Gens mittels PCR. In diesem Schritt wird ein Startcodon (ATG) an das 5'-Ende der amplifizierten DNA angefügt.
- In vitro-Transkription und Translation des Produkts.
- Nachweis des übersetzten Proteins durch Polyacrylamidgel Elektrophorese.
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist eine Technik zur Analyse von Proteinen auf der Grundlage ihrer Größe. Sie ist sehr ähnlich zu Agarosegel-Elektrophorese, die zur Analyse von DNA nach der PCR verwendet wird. Anders als DNA können Proteine in komplexe 3D-Strukturen gefaltet werden. Bevor man sie auf dem Gel laufen lässt, muss man diese 3D-Struktur der Proteine zunächst denaturieren und linear machen. Dies geschieht durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS), einem Detergens, das die Proteine auflöst und linear macht. SDS ist auch erforderlich, um die Proteine negativ aufzuladen.
Wenn die Proteine linearisiert sind und eine negative Ladung haben, können wir sie auf ein Polyacrylamidgel auftragen und elektrisch aufladen. Die negativ geladenen Proteine wandern durch das poröse Polyacrylamid in Richtung des positiven Pols, der sich am Ende des Gels befindet. Die längeren Proteine wandern langsamer als die kürzeren; auf diese Weise können wir die Proteine mit Hilfe der Polyacrylamid-Gelelektrophorese anhand ihrer Länge trennen. Beim Protein Truncation Test wandern die Wildtyp-Proteine langsamer als die verkürzten Proteine, die kürzer sind.