Referenzgene

Referenzgene werden auch als Housekeeping-Gene bezeichnet und sind in der Regel für die Zelle essenziell, da sie für grundlegende Zellfunktionen benötigt werden. Es wird erwartet, dass Referenzgene in den meisten Zellen eines Organismus unter normalen und auch unter kranken Bedingungen in relativ konstanten Mengen exprimiert werden.

Unterschiede im RNA-Expressionsniveau zwischen zwei Proben können sowohl auf echte biologische Variation als auch auf technische Schwankungen zurückzuführen sein. Es ist sehr wichtig, die technische Abweichung zu minimieren, indem eine angemessene Normalisierung auf stabil nachgewiesene Referenzgene vorgenommen wird. Dieses Verfahren ermöglicht eine bessere Einschätzung der tatsächlichen biologischen Variation. Die Referenzgene werden zur Normalisierung der qPCR-Daten verwendet. In der Tat können viele Faktoren zur Variabilität der Probenanalyse beitragen, aber in der Regel hängt sie mit der Effizienz der reversen Transkription für jede Probe zusammen. Je mehr Verunreinigungen in einer RNA-Probe verbleiben, desto weniger effizient ist die reverse Transkriptionsreaktion und dieser Effekt variiert zwischen den Proben.

Referenzgene können je nach Versuchsbedingungen variieren, daher muss man immer mehrere testen und beurteilen, welche im entsprechenden Umfeld am stabilsten sind. Typische Referenzgene sind GAPDH (Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase) und ACTB (das Gen, das beta-Actin kodiert). Es gibt mehrere Programme, mit denen die Stabilität potenzieller Referenzgene getestet werden kann (z. B. GeNorm, NormFinder). Diese Programme können verwendet werden, um die besten 2–3 Referenzgene für ein Projekt auszuwählen.