Reporter-Gen
Ein Reporter-Gen ist ein Gen, das bei seiner Expression ein bestimmtes Merkmal aufweist. Aufgrund dieses eindeutigen Merkmals, das sich einfach identifizieren und messen lässt, kann dieses Reportergen verwendet werden, um die Expression eines bestimmten Gens zu überwachen.
Grün fluoreszierendes Protein
In diesem Fall wurde das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Quallen (Aequorea victoria) als Reporter-Gen verwendet, weil es hellgrünes Licht (λ = 509 nm) aussendet, wenn es mit UV- oder blauem Licht (λ max = 395 nm, minor 475 = nm) angeregt wird. Violettes/blaues Licht bewirkt eine Decarboxylierungsreaktion von Glu22, die die Bildung der anionischen fluoreszierenden Form des Chromophors unterstützt. Wenn das Gen von Interesse (Gene of interest, GOI) exprimiert wird, wird auch GFP exprimiert, was zu einer hellgrünen Zelle/Kolonie führt. Wenn GOI jedoch nicht exprimiert wird, leuchten die Zellen und Kolonien nicht hellgrün.
Bei Aequorea victoria ist das Protein Aequorin für die Fähigkeit zur Biolumineszenz verantwortlich. Dieses Protein emittiert blaues Licht, wenn es sich mit Ca2+-Ionen verbindet. Das blaue Licht wird dann von GFP absorbiert, das es in grünes Licht umwandelt.
Tet-on- und Tet-off-System
Tet-off-System. Aktivator: tTA, Operator: TRE, Promotor: Pcmv, Dox: Doxycyclin. Die Transkription des interessierenden Gens wird in Gegenwart von Doxycyclin blockiert
Die Genexpression kann mit Hilfe eines Regulatorgens gesteuert werden. Ein Regulatorgen kann die Genexpression regulieren, indem es bestimmte Proteine oder miRNA exprimiert, die den Transkriptionsprozess des Gens blockieren oder aktivieren. Eines der am häufigsten verwendeten Regulatorgene ist das Tet-off- und Tet-on-System, das Tetracyclin (Tc) oder Doxycyclin (Dox, ein Tc-Derivat) als Schalter verwendet. Beim Tet-off-System wird die Genexpression ausgeschaltet, wenn Tc oder Dox im Medium vorhanden ist, während beim Tet-on-System die Genexpression eingeschaltet wird, wenn Dox vorhanden ist. Das Tet-on-System reagiert nur auf Dox, aber nicht auf Tc. In diesem Fall wird die Expression des GOI durch das Tet-off-System gesteuert.
Wichtige Bestandteile des Tet-off-Systems sind:
- Regulierendes Protein
Das Regulierungsprotein, das am Tet-off-System beteiligt ist, ist ein Tetracyclin-gesteuerter Transaktivator (tTA), der als Aktivator wirkt. In diesem Fall sind die verwendeten Hefen stabile Zelllinien, die ein Tet-off-Regulatorplasmid enthalten, das für das Protein tTA kodiert.
- Response-Plasmid
Das Response-Plasmid exprimiert ein Gen von Interesse (in diesem Fall RAD52-eGFP) unter der Kontrolle des Tetracyclin-Response-Elements (TRE). Wichtige Elemente im Response-Plasmid sind TRE, Promotor und das GOI. TRE fungiert als Operator, der die Transkription des GOI steuert. Das GOI wird nur exprimiert, wenn tTA an TRE bindet und die GOI-Transkription unter Bedingungen aktiviert, in denen kein Tc oder Dox vorhanden ist. Tc oder Dox können an tTA binden, so dass es nicht mehr an TRE binden kann, wodurch das GOI nicht exprimiert wird.
Transilluminator
Der Transilluminator wird üblicherweise für die Visualisierung von Fluoreszenzmarkern verwendet. Der Transilluminator besteht aus einer UV-Lichtquelle, einer blauen Lichtquelle und der zugehörigen Elektronik, die in einem Gehäuse mit entsprechenden optischen Filtern untergebracht sind. Ein Transilluminator muss vorsichtig verwendet werden, da er ultraviolette Strahlung (üblicherweise zwischen 302 nm und 365 nm) aussendet, die das menschliche Gewebe in den Augen und der Haut schädigen kann.