Restriktionsenzyme
Restriktionsenzyme spalten das Zucker-Phosphat-Grundgerüst der doppelsträngigen DNA. Sie erkennen eine bestimmte Stelle der doppelsträngigen DNA und spalten sie innerhalb oder angrenzend an ihre Erkennungsstelle. Die optimale Aktivität der einzelnen Restriktionsenzyme wird von Bedingungen wie Temperatur, pH-Wert, Enzym-Cofaktor, Salzzusammensetzung und Ionenstärke beeinflusst.
Reaktionsbedingungen
Die Inkubationstemperatur hat großen Einfluss auf die Aktivität des Restriktionsenzyms. Im Allgemeinen spiegelt die Inkubationszeit die Wachstumstemperatur des Bakterienstamms wider, aus dem das Enzym stammt. Die meisten Restriktionsenzyme haben eine optimale Temperatur von 37 °C und einen optimalen pH-Wert von 7,2 oder 8,5. Diese physikalischen Umgebungsbedingungen müssen erfüllt sein, damit das Enzym seine maximale Aktivität entfalten kann. Außerhalb des erwünschten Bereichs der physikalischen Bedingungen kann das Enzym denaturieren. Enzyme arbeiten sehr spezifisch; daher funktionieren sie nicht einwandfrei, wenn sich ihre Struktur verschlechtert. Da jedes Restriktionsenzym aus verschiedenen Bakterien isoliert wird und unterschiedliche optimale Reaktionsbedingungen aufweist, benötigen sie spezifische Puffer, die für jede Restriktionsreaktion verwendet werden.
Arten von Restriktionsenzymen
Restriktionsenzyme können aufgrund ihrer Erkennungssequenz, der Zusammensetzung der Untereinheiten, der Spaltposition und der Anforderungen an die Cofaktoren in 4 Gruppen eingeteilt werden. Die wesentlichen Unterschiede zwischen ihnen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1. Arten von Restriktionsenzymen
| Typen | Eigenschaften |
|---|---|
| Typ I | Das Restriktionsenzymsystem vom Typ I besteht aus einem Enzym mit verschiedenen Untereinheiten für Erkennung, Spaltung und Methylierung. Dieses Enzym erkennt und methyliert an der gleichen Sequenz, spaltet aber DNA bis zu 1000 Basenpaare entfernt von der ursprünglichen Erkennungsstelle. |
| Typ II | Das Restriktionsenzym vom Typ II umfasst zwei verschiedene Enzyme, die die Erkennungssequenz spalten oder verändern. |
| Typ III | Das Restriktionsenzymsystem des Typs III besteht aus einem Enzym mit zwei verschiedenen Untereinheiten, die jeweils für die Erkennung und die Modifikation oder Spaltung zuständig sind. Dieses Enzym erkennt und methyliert an der gleichen Sequenz, spaltet aber 24-26 Basenpaare von der ursprünglichen Erkennungsstelle entfernt. |
| Typ IIs | Das Restriktionsenzymsystem des Typs IIs besteht aus zwei verschiedenen Enzymen mit asymmetrischer Erkennungssequenz. Die Spaltung erfolgt auf einer Seite der Erkennungsstelle, die bis zu 20 Basenpaare entfernt ist. |
Der nützlichste Typ von Restriktionsenzymen, der im Handel erhältlich ist, ist das Typ-II-Restriktionsenzym. Da es aus zwei verschiedenen Enzymen besteht, ist es möglich, DNA ohne Veränderung zu spalten. Außerdem benötigt die Aktivität des Typ-II-Restriktionsenzyms keinen Cofaktor wie ATP oder S-Adenosylmethionin.
Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms
Die meisten Restriktionsenzyme vom Typ II erkennen und spalten DNA innerhalb einer bestimmten Sequenz von 2-8 Nukleotiden, die palindromisch ist. Eine palindromische Sequenz bedeutet, dass die Nukleotidbasenfolge rückwärts (3'-5'-Richtung) und vorwärts (5'-3'-Richtung) gleich lautet. Restriktionsenzyme vom Typ II erzeugen drei verschiedene Enden:
a) Stumpfes Ende
Diese Art von Enzym schneidet genau an der gleichen Stelle in beide DNA-Stränge und erzeugt DNA-Fragmente mit stumpfem Ende ohne Überhänge.
b) 5' klebriges Ende
Dieser Enzymtyp schneidet asymmetrisch innerhalb der Erkennungsstelle, so dass sich ein kurzes einzelsträngiges Segment von den 5'-Enden aus erstreckt.
c) 3' klebriges Ende
Diese Art von Enzym schneidet asymmetrisch innerhalb der Erkennungsstelle, so dass sich ein kurzes einzelsträngiges Segment von den 3'-Enden aus erstreckt.
Tabelle 2. Erkennung von Restriktionsenzymen
| Enzym | Erkennungssequenz | Enden |
|---|---|---|
| HindIII | A/AGCTT | 5'klebrige Enden |
| BglI | GCCNNNN/NGGC | 3'klebrige Enden |
| EcoRI | G/AATTC | 5'klebrige Enden |
| BamHI | G/GATCC | 5'klebrige Enden |
| EcoRV | GAT/ATC | stumpfe Enden |
| SalI | G/TCGAC | 5'klebrige Enden |
| FaeI | CATG/ | 3'klebrige Enden |
| KpnI | GGTAC/C | 3'klebrige Enden |
| XhoI | C/TCGAG | 5'klebrige Enden |
| DpnI | GA/TC | stumpfe Enden |
| SmaI | CCC/GGG | stumpfe Enden |
| XbaI | T/CTAGA | 5'klebrige Enden |