Reverse Transkription PCR

Nicht alle Gene werden ständig in allen Zellen exprimiert. Eine Zelle muss die DNA-Sequenz in mRNA umschreiben, um das kodierte Protein herzustellen. Daher entspricht das Niveau der Genexpression dem Niveau der mRNA. Die Genexpression kann mit einer reversen Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gemessen werden. Die RT-PCR besteht aus folgenden Schritten:

Umwandlung der RNA in cDNA mittels reverser Transkriptase
Amplifikation der cDNA mittels PCR

Abbildung 1: Schritte zur Herstellung von cDNA aus einer mRNA-Vorlage. Unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primers wird mRNA in cDNA umgeschrieben, gefolgt von einer Hydrolyse des RNA-Strangs.

mRNA ist empfindlicher als DNA und kann nicht durch PCR amplifiziert werden. Aus diesem Grund wird mRNA in komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt. cDNA ist DNA, die aus Boten-RNA-Molekülen synthetisiert wird. Die cDNA-Synthese wird durch ein Enzym namens reverse Transkriptase katalysiert, das RNA als Vorlage für die DNA-Synthese verwendet. Reverse Transkriptase wurde ursprünglich aus einem Retrovirus entdeckt und isoliert. Diese Viren enthalten ein RNA-Genom; daher müssen die Viren eine cDNA-Kopie ihres Genoms herstellen, um mit der molekularen Maschinerie der Wirtszelle kompatibel zu sein.

Die RT-PCR-Reaktion umfasst die folgenden Schritte:

Ein Oligo(T)-Fragment wird als Primer verwendet, um an den 3'-Poly(A)-Schwanz jeder mRNA zu binden.
Die reverse Transkriptase verwendet die RNA als Vorlage, um cDNA-Stränge zu synthetisieren.
Das entstandene RNA-cDNA-Hybrid wird durch Erhöhen der Temperatur aufgetrennt.
Ein genspezifischer Primer bindet an seine komplementäre Sequenz.
Die DNA-Polymerase erzeugt den komplementären DNA-Strang, ausgehend von der Primer-Bindungsstelle.
Die Stränge werden durch Erhöhen der Temperatur getrennt und der PCR-Zyklus wird wiederholt.

Am Ende der RT-PCR-Reaktion liegen Milliarden von Kopien des interessierenden Gens vor, wenn das Gen exprimiert wurde. Die Anzahl der DNA-Kopien kann durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden.