Quantifizierung von Nukleinsäuren

Für die Quantifizierung wird die Spektralphotometrie empfohlen. Diese Technik liefert dir Informationen über die Konzentration der Nukleinsäure in deiner Probe und zwei Verhältnisse, die die Qualität der Probe beschreiben: 260/280 und 260/230. Um Informationen zur RNA-Integrität zu erhalten, sind noch weitere Techniken erforderlich.

Das 260/280-Verhältnis reflektiert die Reinheit von DNA und RNA. Bei 260 nm misst du Nukleinsäuren und bei 280 Proteine. Das empfohlene 260/280-Verhältnis sollte zwischen 1,8 und 2,1 liegen. Wenn das Verhältnis geringer ist, kann das auf die Verunreinigung der Probe mit Protein oder anderen Kontaminanten hinweisen, die bei 280 nm absorbieren.

Das 260/230-Verhältnis wird als zweiter Maßstab für die Reinheit der Nukleinsäure verwendet. Bei 260 nm misst du Nukleinsäuren und bei 230 nm misst du von der Isolation in deiner Probe verbliebene Chemikalien. Der Wert von 260/230 sollte zwischen 2,0 und 2,2 liegen. Wenn das Verhältnis geringer ist, kann das auf die Anwesenheit von Kontaminanten hinweisen, die bei 230 nm absorbieren (z. B. Phenol).

Messung mit dem Spektralphotometer.

Die Konzentration von Nukleinsäuren kann durch die Messung ihrer Absorption mit einem Spektralphotometer wie dem NanoDrop bestimmt werden.

Die Absorption wird bei 260nm (A260) gemessen, wo die Nukleinsäuren das Licht am stärksten absorbieren. Die Menge an absorbiertem Licht ist proportional zur Menge der Nukleinsäure in der Probe.

Die Beziehung zwischen der Konzentration und der Absorption wird durch das Beer-Lambert-Gesetz beschrieben: A = c * ε * L, oder c = A / (ε * L), wobei gilt:

• c : die Nukleinsäurekonzentration in Molar.

• A : die Absorption in AU.

• ε : der wellenlängenabhängige molare Extinktionskoeffizient (auch molares Absorptionsvermögen genannt) in Molar/cm.

• L : die Schichtdicke in cm (beim NanoDrop beträgt dieser Wert 10 mm).

Diese Abbildung stellt das Ergebnis einer RNA-Quantifizierung einer hochqualitativen RNA-Probe dar.