Vorbereitung der RT-qPCR

Wenn die RNA aus der Probe extrahiert und in cDNA revers transkribiert wurde, kann man die Transkripte mit RT-qPCR quantifizieren.

Das Transkript kann nur relativ zu einem Referenzgen quantifiziert werden. Bei den Referenzgenen handelt es sich in der Regel um Gene, die für die Zelle essenziell sind, da sie für grundlegende zelluläre Funktionen benötigt werden. Es wird erwartet, dass Referenzgene in den meisten Zellen eines Organismus sowohl unter normalen als auch unter kranken Bedingungen in relativ konstanten Mengen exprimiert werden.

Wähle ein Referenzgen und entwirf Primerpaare speziell für dein Ziel- und Referenzgen.

Bevor du mit dem qPCR-Experiment beginnst, musst du Mastermixe für jedes deiner Primerpaare herstellen. Verwende genau die gleiche Konzentration der Primer und füge das qPCR-Reagenz hinzu.

Das qPCR-Reagenz enthält:

• SYBR-Green, das fluoresziert, wenn es an doppelsträngige DNA gebunden ist.

• DNA-Polymerase zur Vervielfältigung der DNA.

Mische deine cDNA-Proben mit jedem Mastermix und starte das qPCR-Experiment.