Sequenzierungsprozess

Nun, da wir eine Durchflusszelle mit einer Menge DNA haben, können wir mit dem Sequenzierungsprozess beginnen. Je nach der von dir verwendeten Plattform gibt es verschiedene Möglichkeiten, das Next Generation Sequencing durchzuführen. Eine davon ist die Sequenzierung durch Synthese, bei der die Sequenzierungsdaten gewonnen werden, indem jedes Basenpaar synthetisiert wird.

Abbildung 1. Sequenzierung durch Synthese. Nachdem sich die Polymerase an den Primer angehängt hat, werden mit einem spezifischen Fluorophor markierte Nukleotide am 3'-Ende des Primers hinzugefügt. Die Nukleotide sind mit einer 3'-Kappe modifiziert, die jeweils nur das Hinzufügen eines Nukleotids erlaubt. Das vom Fluorophor emittierte Fluoreszenzsignal wird erkannt, und die 3'-Kappe wird gespalten, so dass der nächste Sequenzierungszyklus beginnen kann.

Polymerase-Anbindung

Sobald sich der klonale DNA-Cluster an die Durchflusszelle angehängt hat, werden die Sequenzierungsreagenzien in die Durchflusszelle gepumpt. Sie treten auf der einen Seite der Durchflusszelle ein und auf der anderen Seite wieder aus. Die T4-DNA-Polymerase wird hineingespült und heftet sich an das kurze, an die Durchflusszelle gebundene DNA-Molekül (das als Sequenzierprimer dient).

Mit Fluorophor markierte Nukleotide

Jedes der vier Nukleotide ist mit einem spezifischen Fluorophor markiert. Zum Beispiel ist Thymin mit einem grünen Fluorophor, Cytosin mit einem blauen Fluorophor, Guanin mit einem roten Fluorophor und Adenin mit einem orangen Fluorophor markiert. Diese Nukleotide sind ebenfalls modifiziert; sie haben eine 3'-Kappe, die nur das Anfügen von jeweils einem Nukleotid erlaubt. Nachdem ein Nukleotid an das 3'-Ende des Primers angefügt wurde, können sich somit keine weiteren Nukleotide mehr anhänge. Die verbleibenden Nukleotide, die frei schweben, werden dann aus dem System gewaschen.

Fluorophor-Detektion

Da alle Nukleotide individuell mit einem bestimmten Fluorophor markiert sind, können wir die Nukleotide durch Beobachtung des Fluoreszenzsignals, das sie aussenden, identifizieren. In Abbildung 1 ist beispielsweise zu sehen, dass ein mit einem grünen Fluorophor markiertes Nukleotid an das 3'-Ende des Primers angefügt ist. Eine chemische Reaktion löst die Emission von grünem Licht aus, das durch eine Fotoaufnahme dokumentiert werden kann. Da wir wissen, dass Thymin mit dem grünen Fluorophor markiert ist, können wir die Base als Thymin identifizieren. Am Ende eines jeden Zyklus werden vier Fotos aufgenommen, wobei jede der möglichen Farben erfasst wird. Nachdem alle vier Bilder aufgenommen wurden, überlagert das System diese, so dass wir die Basenidentität jedes Clusters leicht erkennen können.

Abspaltung und Entfernung

Nach der Aufnahme des Bildes wird die 3'-Kappe des Nukleotids abgespalten, damit der nächste Sequenzierungszyklus beginnen kann. Die abgespaltene 3'-Kappe wird dann aus dem System entfernt. Dies markiert das Ende eines Sequenzierungszyklus und der neue Zyklus kann beginnen, indem neue Durchläufe von Nukleotiden eingespült und die Schritte wiederholt werden.

Für weitere Informationen: - Single- vs. Paired-End-Sequenzierung