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Spektralphotometer

Ein Spektralphotometer ist ein Gerät, das Informationen über die Intensität der abgestrahlten Energie liefert, und das in der Lage ist, das Verhältnis zwischen der Intensität des von einer internen Quelle ausgestrahlten Lichts und dem Licht, das eine bestimmte Lösung durchdringt, zu bestimmen. Dieses Verhältnis kann zur Bestimmung der Konzentration von gelösten Molekülen in einer Probe herangezogen werden.

Vor der Messung einer Probe stellt man das Spektralphotometer so ein, dass es bei einer bestimmten Wellenlänge misst. Die erkannte Wellenlänge kann auf einen Wert eingestellt werden, der für die Messung einer bestimmten Verbindung optimal ist.

Bei der Messung liefert das Spektralphotometer die Daten als Absorptionswerte (A). Die Absorption wird als log(I0/It) berechnet. Dabei ist I0 die Intensität des einfallenden Lichts (Licht, das auf eine Probe fällt) und It die Intensität des Lichts, das durch die Lösung und auf einen Fotodetektor fällt.

Die Beziehung zwischen Absorption und Konzentration ist linear und wird durch das Lambert-Beer'sche Gesetz beschrieben:

A = εcl

Dabei ist c die Konzentration der Lösung, l die Weglänge, also die Strecke, die das Licht beim Durchqueren einer Lösung zurücklegt (normalerweise die Breite einer Küvette), und ε ist der Extinktionskoeffizient, der spezifisch für eine Verbindung ist.

Eine Darstellung der Bauteile eines Spektralphotometers. Von links nach rechts wird das Licht von einer Lichtquelle ausgestrahlt, wobei die Pfeile den Weg des Lichts darstellen. Die Pfeile zeigen nach rechts, zu einem Kollimator, der als ovale Linse dargestellt ist, durch die das Licht fällt. Dann zeigen die Pfeile wieder nach rechts, und das Licht läuft durch einen prismenförmigen Monochromator. Vom Monochromator aus wird das Licht in einem breiteren Feld gestreut, das alle Wellenlängen in verschiedenen Farben zeigt. Das Licht erreicht einen Wellenlängenwähler oder eine Blende. Nur eine spezifische Wellenlänge wird durchgelassen: hier als gelbe Lichtlinie dargestellt. Die gelbe Linie wandert dann durch eine zylinderförmige Küvette, die mit einer Probenlösung gefüllt ist. Auf der linken Seite der Küvette befindet sich I 0 und auf der rechten Seite der Küvette I t. Am Ende des Spektralphotometers befindet sich eine Fotozelle oder ein Detektor, der die Intensität des Lichts misst, das die Küvette durchläuft, und die Ergebnisse werden auf einem digitalen Display angezeigt, das auch als Messgerät bezeichnet wird

Abbildung 1: Bauteile eines Spektralphotometers: Das von der Lichtquelle ausgestrahlte Licht wird durch eine Blende geleitet, die nur eine bestimmte Wellenlänge durchlässt. Dieses Licht dringt teilweise durch die in einer Küvette befindliche Probe und der Detektor misst die Intensität auf der anderen Seite der Küvette.

Wir wollen beispielsweise die Konzentrationen von NADH messen. NADH hat ein Absorptionsmaximum bei 340 nm. Deshalb stellen wir das Spektralphotometer auf diese Wellenlänge ein. Der Extinktionskoeffizient für NADH, ε = 6220 M-1cm-1. Die Streckenlänge ist die Breite der Küvette, also 1 cm.

Es gibt einige Grenzen des Lambert-Beer'schen Gesetzes, die man bei der Verwendung von Spektralphotometern beachten muss. Einige davon sind technischer Natur, doch das Gesetz hat auch eine echte Einschränkung: Es gilt nämlich nur für verdünnte Lösungen. Wenn die Konzentration einer absorbierenden Spezies steigt, nimmt auch die Häufigkeit der physikalisch-chemischen Wechselwirkungen zwischen den Molekülen zu. So beginnen die Moleküle bei einer bestimmten Konzentration, die Ladungsverteilung der Nachbarmoleküle zu beeinflussen. In diesem Fall ist die Beziehung zwischen Absorption und Konzentration nicht mehr linear. Als Faustregel gilt, dass man bei Messungen unter einem Absorptionswert von 1 bleiben sollte.

Die Absorption ist umgekehrt proportional zur Transmission (Licht, das durch eine Probe hindurchgeht und nicht absorbiert wird). Wenn die Absorption = 1 ist, werden 10 % des Lichts durch die Probe durchgelassen, bei 2 wird 1 % des Lichts durchgelassen und so weiter in einem logarithmischen Trend.