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Wirkungsweise des Spektralphotometers

Das Spektralphotometer ist so eingestellt, dass es nur bei einer bestimmten Wellenlänge misst; diese Wellenlänge kann so eingestellt werden, dass die optimale Wellenlänge für die Messung der spezifischen Verbindung verwendet wird. Das Spektralphotometer zeigt die sogenannte Absorption (A) an. Diese wird als log(It/I0) berechnet, wobei I0 die Intensität des einfallenden Lichts und It die Intensität des Lichts ist, das durch die Lösung dringt und vom Spektralphotometer gemessen wird. Es besteht eine lineare Beziehung zwischen Absorption und Konzentration; diese Beziehung wird durch das Lambert-Beer'sche Gesetz wie folgt beschrieben:

A = log (I0 / It) = ε • c • l

Dabei ist c die Konzentration der Lösung, l die Länge der Lösung (durch die das Licht hindurchgehen muss) und ε der Extinktionskoeffizient, der spezifisch für eine Verbindung ist. [1]

Ein Spektralphotometer besteht aus folgenden Komponenten (Abb. 1):

  • Lichtquelle

  • Vorrichtung zum Einstellen der Wellenlänge

  • Probenbehälter (z. B. eine Küvette)

  • Strahlungswandler

  • Detektor

Die schwarze gerade Linie verläuft von der Lichtquelle, die als Glühbirne dargestellt ist, zur Spitze einer blauen Pyramide, die mit Monochromator beschriftet ist. Von dort aus biegt dieselbe gerade Linie, die jetzt mit I-Null beschriftet ist, in die Horizontale ab und tritt durch eine dicke, schwarze, vertikale Linie, die mit einstellbare Blende beschriftet ist. Hinter der Blende befindet sich ein vertikal ausgerichtete Rechteck, die Küvette, mit einer grünen Lösung, der Probe. Die l-Null-Linie verläuft durch die Küvette mit der Probe, ändert ihren Namen in I und endet an einem elliptischen Gebilde, dem Fotoresistor. Der Fotoresistor ist mit einem weiteren Dreieck, dem Verstärker, verbunden, der wiederum mit einem gelben Rechteck verbunden ist, in dem die Ausgabe von 0,260 A angezeigt wird.

Abbildung 1: Das von der Lichtquelle ausgestrahlte Licht wird durch den Spalt der Blende geleitet, wobei nur eine bestimmte Wellenlänge durchgelassen wird. Dieses Licht durchdringt die Probe in der Küvette und wird vom Detektor gemessen.

Als Beispiel messen wir die Konzentrationen von NADH. NADH hat ein Absorptionsmaximum von 340 nm; daher wird das Spektralphotometer auf die Messung bei dieser Wellenlänge eingestellt. Der Extinktionskoeffizient für NADH wird wie folgt berechnet: ε =6220 M-1cm-1. Die Länge der Lösung wird normalerweise auf 1 cm eingestellt.

Bei der Untersuchung müssen bestimmte Einschränkungen des Lambert-Beer'schen Gesetzes berücksichtigt werden. Einige davon haben mit technischen Fragen zu tun; das Gesetz hat jedoch eine echte Einschränkung, da es nur für verdünnte Lösungen gilt. Wenn die Konzentration eines absorbierenden Stoffes steigt, nehmen auch die physikalisch-chemischen Wechselwirkungen zwischen den Molekülen zu. So beginnen die Moleküle bei einer bestimmten Konzentration, die Ladungsverteilung der benachbarten Moleküle zu beeinflussen. Wenn dies geschieht, ist die Beziehung zwischen Absorption und Konzentration nicht mehr linear. Als Faustregel gilt, dass man bei Messungen unter einem Absorptionswert von 1 bleiben sollte.

Die Absorption ist umgekehrt proportional zur sogenannten Transmission (Details siehe Lehrbuch). Bei einem Absorptionswert von 1 werden 10 % des Lichts durch die Probe durchgelassen; bei 2 wird 1 % des Lichts durchgelassen, und so weiter in logarithmischer Reihenfolge.

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