Standardkurve
Die Effizienz der PCR-Reaktion ist sehr wichtig für die korrekte Interpretation der qPCR-Ergebnisse. Sie ist abhängig vom Assay, der Leistung des Mastermixes und der Qualität der Probe. Sie wird auf der Grundlage einer Standardkurve berechnet.
Eine Standardkurve wird aus mehreren qPCR-Reaktionen mit einer 10fachen Verdünnungsreihe der DNA erstellt. Die Verdünnungsreihe kann aus einem Pool der zu testenden cDNA-Proben erstellt werden, die nacheinander 10-fach verdünnt werden. Um eine Standardkurve zu erstellen, muss man die für jede Verdünnung erhaltenen Ct-Werte (oberer Teil der Abbildung unten) gegen den Logarithmus der für die Erstellung der Standardkurve verwendeten Verdünnungsfaktoren (VF) auftragen. Die Standardkurve ist dann die Regressionslinie durch diese Punkte (unterer Teil in der Abbildung unten, linke Seite). Die Steigung der Regressionslinie wird durch die Formel in der Abbildung unten mit der Amplifikationseffizienz in Beziehung gesetzt. Im Allgemeinen wird eine Effizienz zwischen 80 und 110 % als akzeptabel angesehen. Bei 100 % verdoppeln Sie die Produktmenge in jedem Zyklus Ihrer PCR-Reaktion. Die Regressionslinie kann auch verwendet werden, um die Konzentration von unbekannten Proben anhand ihrer Ct-Werte zu bestimmen.