qPCR Analyse

Die qPCR Ergebnisse bestehen aus einer Schmelzkurve und einem Amplifikationsdiagramm.

• Die Schmelzkurve zeigt, bei welcher Temperatur die DNA-Stränge schmelzen/trennbar werden. Dies ist sehr nützlich, um zu beurteilen, ob man nur die Amplifikation des Transkripts misst oder ob es Verunreinigungen gibt.

• Das Amplifikationsdiagramm zeigt die Veränderung der Fluoreszenz als log (ΔRn) in jedem PCR-Zyklus.

Der Zyklus, bei dem die Fluoreszenz einen bestimmten Schwellenwert überschreitet, wird als Ct-Wert bezeichnet (auch Cq für Quantifizierungszyklus genannt). Ein niedriger Ct-Wert deutet auf eine große Menge an Ausgangstranskript hin, da nur wenige Zyklen erforderlich waren, um die Fluoreszenzschwelle zu erreichen, und somit auf eine hohe Expression des untersuchten Gens. Ein hoher Ct-Wert deutet auf eine geringe Menge an Ausgangstranskript hin, da eine hohe Anzahl von Amplifikationszyklen erforderlich war, um die Fluoreszenzschwelle zu erreichen, und somit auf eine geringe Expression des Gens.

Zunächst sollte man prüfen, ob die Negativkontrollen ein Signal erzeugen. Liegt bei diesen Wasserkontrollen ein Signal vor, ist das Experiment mit Fremd-DNA kontaminiert und die Ergebnisse sind nicht gültig.

Es gibt verschiedene Methoden, um die relativen Mengen der einzelnen DNA aus der gemessenen Fluoreszenz zu berechnen. Die gängigste Methode ist die Delta-Delta-Ct-Methode.