Transformation (Biotechnologische Technik)

Die Transformation ist eine wichtige Technik, um exogene DNA in eine Wirtszelle einzufügen. Eine der vielen Techniken zur Zelltransformation ist die Elektroporation. Dabei handelt es sich um eine mechanische Transformationsmethode, die elektrische Impulse verwendet, um vorübergehende Poren in der Zellmembran zu erzeugen. Die Poren ermöglichen es dem DNA-Molekül, die Zellmembran zu passieren und in die Zelle einzudringen. Die hohe elektrische Spannung bewirkt, dass sich an der Zellmembran hydrophobe Poren mit einer Größe von etwa 2 nm bilden.

Parameter der Elektroporation

• Spannung

Die elektrischen Bedingungen für die Elektroporation sind für jeden Mikroorganismus unterschiedlich. Hefe, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae, hat einen optimalen elektrischen Zustand von 40μl Zelle, 1,5 kV für etwa 5 ms.

• Zelle

Elektrokompetente Zellen werden verwendet, um die Effizienz der Elektroporation zu erhöhen. Unter Kompetenz versteht man die Fähigkeit einer Zelle zur Aufnahme von extrazellulärer („nackte“) DNA aus ihrer Umgebung. Hefezellen werden elektrokompetent gemacht, indem sie in nichtionischer Lösung gewaschen werden, um alle Salze zu entfernen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Ladung nicht durch das Medium geleitet wird. Die optimale Elektroporation für Hefe wird erreicht, wenn Hefe aus dem mittleren oder späten logarithmischen Phase verwendet wird. Die logarithmische Phase der Hefe kann in drei Abschnitte unterteilt werden:

• Frühe Log-Phase: der Zeitraum, in dem die Zelldichten etwa 10⁷ Zellen/ml beträgt.
• Mittlere Log-Phase: Die Kulturen weisen Dichten zwischen 1 und 5 × 10⁷ Zellen/ml.
• Späte Log-Phase: tritt auf, wenn die Zelldichten zwischen 5 × 10⁷ und 2 × 10⁸ Zellen/ml beträgt.

In der logarithmischen Phase ist die Wachstumsrate schnell, und die Zellteilungsrate übersteigt die Zelltodrate. Die Zellen sind stoffwechselaktiv und verfügen über eine ausreichende Genomreplikation, um eine effiziente DNA-Reparatur durchzuführen. Daher können Zellen in dieser Phase eine harte Behandlung wie die Elektroporation vertragen.

• DNA

Die Häufigkeit der Transformation steigt mit zunehmender DNA-Konzentration im Elektroporationspuffer. Bitte beachte aber, dass eine zu hohe DNA-Konzentration auch die Transformationseffizienz verringern kann. Die genaue DNA-Konzentration muss für jedes Experiment einzeln bestimmt werden.

• Elektroporationsmedien

Um eine Lichtbogenbildung während der Elektroporation zu vermeiden, ist es wichtig, die elektrokompetente Zelle gründlich zu waschen, um das Wachstumsmedium aus der Zelle zu entfernen. Das Waschen kann mit Wasser oder mit einer nichtionischen Lösung wie Glucose, Glycerin, Saccharose, Sorbitol oder Polyethylenglykol durchgeführt werden. Das Vorhandensein von ionischem Material kann während der Elektroporation zu Lichtbogenbildung führen.

Sorbitol wird vorzugsweise verwendet, weil es als nicht permeierendes Kälteschutzmittel wirkt, das die Schädigung der Zellmembran beim Auftauen deutlich reduziert. Schäden an der Membran verringern die Transformationseffizienz erheblich.

Während des Elektroporationsverfahrens steigt die Temperatur an und die Zellen erfahren Membranverletzungen durch schnellen Wasserein und -ausfluss aufgrund eines großen extrazellulären und intrazellulären osmotischen Ungleichgewichts. Diese Art der Schädigung kann durch einen osmotischen Stabilisator wie Sorbitol verhindert werden. Sorbitol wirkt also als Kälteschutzmittel und Osmoregulator.

Verbreitung

Der Begriff Verbreitung bezieht sich auf eine Methode zur gleichmäßigen Verteilung von Bakterien über die Oberfläche eines Agarplattenmediums. Ein kleines Volumen einer mikrobiellen Kultur wird mit einem Glasausstreicher gleichmäßig auf der Agaroberfläche verteilt. Vorgehensweise beim Verbreiten:

• Ein Glasausstreicher sollte mittels der Hitze des Bunsenbrenners sterilisiert werden. Tauche den Glasausstreicher zunächst in Alkohol (70 % Ethanol), schüttele den überschüssigen Alkohol ab und entzünde den Rückstand. Lasse den Spatel dann abkühlen.
• Verteile die mikrobielle Kultur gleichmässig auf der Oberfläche der Medienplatte. Der Druck wird gleichmäßig ausgeübt, während das Glas auf der Medienoberfläche verteilt.
• Lasse die Medienplatte die mikrobielle Kultur aufsaugen.
• Inkubiere die Platte mit der Oberseite nach unten, um Wassertropfen (Kondensation) auf der Platte zu vermeiden.

Es ist wichtig, eine einzige Kolonie auszuwählen, um reine genetische Klone zu isolieren. Eine Kolonie ist eine Gruppe von Zellen, die aus der gleichen Quelle stammen; Daher enthalten alle Zellen einer Kolonie die gleiche genetische Informationen.

Antibiotische Selektion

Das beim molekularen Klonieren verwendete Medium ist ein reichhaltiges Medium, das das mikrobielles Wachstum fördert. Selektive Medien können verwendet werden, um Verwechslungen bei der Auswahl zwischen transformierten Kolonien und nicht transformierten Kolonien zu vermeiden. Ein Selektivmedium wird hergestellt, indem Antibiotika wie Ampicillin, Hygromycin, Zeocin-Bleomycin-Derivat und Kanamycin zugesetzt werden. Das Antibiotikum muss mit dem in einem Plasmidvektor kodierten Antibiotikaresistenzgen übereinstimmen, d. h. wenn ein Plasmidvektor ein β-Lactamase-Gen (Ampicillin Resistenzgen) enthält, muss Ampicillin als Selektionsmittel verwendet werden.

Mikroben, die transformiert wurden, enthalten das spezielle Antibiotikaresistenzgen, das im Plasmidvektor kodiert ist. Das Antibiotikum Resistenzgen ermöglicht die Selektion der transformierten Kolonien aus den nicht transformierten Kolonien. Da die transformierten Kolonien bestimmte Proteine exprimieren, die für die Resistenz gegen die Antibiotikawirkung erforderlich sind, können sie in dem Medien überleben, in denen die nicht transformierten Kolonien nicht überleben können.

Die Wirksamkeit eines bestimmten Antibiotikaresistenzsystems wird wird beeinflusst durch:

• Das selektive Mittel (Antibiotikum)

Es sollte das nicht transformierte Wachstum vollständig hemmen.

• Das Resistenzgen

Es sollte das Protein exprimieren, das erforderlich ist, um der Wirkung des selektiven Mittels vollständig zu widerstehen. Die Expression des resistenten Gens kann durch Transkriptions- und Translationskontrollsignale gesteuert werden, die ihm zugeführt werden.

• Das zu wählende Material

Das Material, das in diesem Fall auszuwählen ist, sind Mikrobenzellen. Die Mikrobenzellen sollten für die antibiotische Wirkung empfindlich sein.

Ampicillin wird üblicherweise für die bakterielle Selektion verwendet. Hefe ist jedoch nicht empfindlich gegenüber Ampicillin und kann daher nicht als selektives Mittel für das Screening von Hefetransformationen verwendet werden. Eines der vielen Antibiotika, die beim Screening von Hefetransformationen verwendet werden können, ist Zeocin. Zeocin ist Teil von Bleomycin/Phleomycin-artigen Antibiotika, die aus Streptomyceten isoliert wurden. Zeocin verursacht den Zelltod durch Bindung und Spaltung der DNA in der Zelle. Sh ble-Gen (Streptoalloteichus kodiert das Zeocin-Resistenzprotein hindustanus Bleomycin-Gen). Dieses Protein bindet an Zeocin auf eine stöchiometrisch Art und Weise an und hemmt so die DNA-Strangspaltungsaktivität von Zeocin.