Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion

Eine gängige Methode zur Isolierung der Gesamt-RNA ist die Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion. Bei dieser Methode wird eine Chemikalie namens TRIreagent (oder TRIzol) verwendet, die Guanidiniumisothiocyanat, ein starkes Proteindenaturierungsmittel, und Phenol, ein organisches Lösungsmittel, enthält. Der TRIreagent-Puffer bewahrt die Integrität der RNA, zerstört die Zellen und denaturiert die Proteine. Diese Methode basiert auf den Forschungen von Piotr Chomczynski und Nicoletta Sacchi aus den Jahren 1987 und 2006. Sie nimmt etwas mehr Zeit in Anspruch als auf Trennsäulen basierende Methoden wie RNAeasy (Qiagen), kann aber größere Mengen an Gewebe oder Zellen verarbeiten und liefert daher mehr RNA.

Die wichtigsten Schritte der RNA-Isolierung sind folgende:

• Zelllyse und Aufbrechen der zellulären Strukturen
• Abtrennung der RNA von Zelltrümmern
• Aufreinigung der RNA von der DNA und den Proteinen
• Fällung der RNA
• Waschen und Resuspendieren der RNA

Das Lysat besteht aus RNA, DNA, Proteinen und Zelltrümmern. Durch Zentrifugation können die Makromoleküle (Proteine, RNA und DNA) von den Zelltrümmern getrennt werden. Eine Phasentrennung der Probe findet statt, wenn der Probe Chloroform zugesetzt wird, und zwar aufgrund der unterschiedlichen Dichten. Darüber hinaus bestimmt der pH-Wert die Trennung der Nukleinsäuren und Proteine. Die polare RNA verbleibt in der oberen polaren Phase, die DNA sammelt sich in der Interphase und die denaturierten Proteine lösen sich in der unteren organischen Phase auf.

Die RNA aus der wässrigen Phase wird durch Zugabe von Isopropanol ausgefällt, wodurch polare Moleküle wie RNA und Salze abgeschieden werden. Die Salze können mit 75%igem Ethanol ausgewaschen werden, um reine RNA zu erhalten. Schließlich wird das RNA-Pellet getrocknet und unter Verwendung von RNase-freiem Wasser als Puffer resuspendiert.

Nach der RNA-Isolierung muss die Konzentration und Reinheit der RNA überprüft werden. Auch die Qualität sollte vor der weiteren Analyse überprüft werden.