Verfahren zur Dissoziation von Trypsin
Trypsin ist eine Serinprotease, die im Verdauungssystem vieler Wirbeltiere vorkommt, wo sie Proteine hydrolysiert. Trypsin spaltet Peptidketten hauptsächlich an der Carboxylseite der Aminosäuren Lysin oder Arginin, es sei denn, auf eine der beiden folgt Prolin. In der Zellkultur wird Trypsin verwendet, um die fokalen Adhäsionen zu brechen, die die Zellkulturschale verankern, sowie die Cadherin-vermittelte Zell-Zell-Adhäsion, so dass wir einzelne Zellen ernten können. Der Wirkungsmechanismus von Trypsin wird durch Serumproteine, Kalzium und Magnesium gehemmt, und in Gegenwart von Kalzium sind die Kadherine resistent gegen Trypsin. Daher enthalten die meisten Trypsinlösungen auch EDTA, das als Kalzium-Chelatbildner wirkt. Außerdem müssen wir unsere Zellen zunächst mit kalzium- und magnesiumfreiem PBS waschen. Schließlich ist es wichtig, die Zellen nicht länger als 2-5 Minuten mit Trypsin zu inkubieren, da Trypsin nach dieser Zeit toxisch für die Zellen sein kann.
In diesem Video wird gezeigt, wie alle erforderlichen Schritte durchgeführt werden:
Normalerweise ist die Trypsinlösung tierischen Ursprungs und muss bei -20 °C gelagert und vor der Verwendung auf 37 °C vorgewärmt werden. Anstelle von Trypsin kann auch TrypLETM verwendet werden. Seine Bestandteile sind tier- und humanfrei, bei Raumtemperatur mindestens 6 Monate lang stabil, werden nicht durch Serum gehemmt und erfordern keine Trypsin-Inaktivatoren.