Proteinnachweis mithilfe von Antikörpern

Der Nachweis des gewünschten Proteins wird durch die Verwendung spezifischer Antikörper ermöglicht. Bevor die Antikörper auf die Membran aufgetragen werden, fügt man eine Blockierungslösung, typischerweise 5 % Rinderserumalbumin (BSA) oder entfettete Trockenmilch, hinzu, um eine unspezifische Proteinbindung zu verhindern.

Im Allgemeinen werden bei Western Blots zwei Antikörper verwendet: Primär- und Sekundärantikörper. Primärantikörper haben eine einzigartige Bindungsstelle, die spezifische Proteine erkennt. Nachdem die Membran mit den Primärantikörpern inkubiert und ungebundene Primärantikörper weggewaschen wurden, fügt man die Sekundärantikörper hinzu. Sekundärantikörper binden selektiv an die Primärantikörper. Die Sekundärantikörper dienen nicht nur als Träger des Nachweismarkers, sondern auch als Verstärker des emittierten Signals. Der an die Sekundärantikörper gebundene Marker ist in der Regel ein Biotin oder ein Reporterenzym wie alkalische Phosphatase (AP) oder Meerrettichperoxidase (HRP).

Abbildung 1: Proteinnachweis mithilfe von Antikörpern

Eine große Auswahl an Sekundärantikörpern mit verschiedenen Markierungssystemen ist in vier Nachweissystemen erhältlich: kolorimetrisch, chemilumineszent, radioaktiv und fluoreszierend.

Wie bei allen Experimenten sollte eine experimentelle Kontrolle verwendet werden. Beim Western Blot dient diese der Überprüfung, ob eine ähnliche Menge der Probe zugegeben wurde und somit die Vergleichbarkeit der Ergebnisse gewährleistet ist. Die häufigste Kontrolle ist Aktin. Dieses Protein wird in allen Zellen in hohen Mengen exprimiert und kann auf einem Western Blot zuverlässig sichtbar gemacht werden.