Probenvorbereitung für Western Blot

Es gibt verschiedene Methoden der Probenvorbereitung, je nachdem ob ein Protein extrazellulär oder intrazellulär ist. Intrazelluläre Proteine sind schwieriger zu extrahieren und ihre Vorgehensweise muss sorgfältig ausgearbeitet werden.

Abbildung 1: Probenvorbereitung für Western Blot

Der zelluläre Aufbau eines jeden Organismus besteht aus einer komplexen Mischung von Molekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren, Polysacchariden und Salzen. Diese Moleküle können die Western Blot Methode stören, daher ist die Probenvorbereitung so wichtig. Es gibt zahlreiche Methoden des Zellaufschlusses, um die Probe für das Western Blotting vorzubereiten. Typischerweise kannst du bei Säugetierzellen die Zellmembran durch Detergenz-Lyse, Gefrier-/Auftau-Lyse oder mechanische Homogenisierung und Beschallung entfernen.

Nach der Extraktion wird die Proteinprobe in einer Lösung gekocht, die einen Tracking-Farbstoff (Bromphenolblau), ein Disulfid-Reduktionsmittel (Beta-Mercaptoethanol) und ein Detergens (Natriumdodecylsulfat/ SDS) enthält. Das Kochen denaturiert das Protein und entfaltet es dadurch. Beta-Mercaptoetanol verhindert die Neubildung von Disulfidbindungen und damit die Unterbrechung der quartären und tertiären Struktur des Proteins, wodurch lineare Kettenpolypeptide entstehen. Natriumdodecylsulfat schränkt das Protein mit einer negativen Ladung ein.