Western-Blot-Fehlerbehebung

Luftblasen

Verursacht durch nicht sorgfältiges Auflegen des Gels und der Membran auf den Stapel oder unzureichendes Entfernen der Luftblasen mit einem Roller oder einer Plastikkarte. Die Luftblase erzeugt eine Tasche, in der kein Puffer und somit keine Leitfähigkeit vorhanden ist. Die Probe wird in diesem Bereich nicht vom Gel auf die Membran übertragen, und die Membran sieht aus, als hätte sie kleine, scharf abgegrenzte leere Stellen, wenn sie mit dem Farbstoff Ponceau S gefärbt wird.

Schlechte Leitfähigkeit

Da der Strom durch Ionen im Puffer geleitet wird, kann eine unzureichende Einweichung zu Bereichen mit schlechter Leitfähigkeit führen. Diese Bereiche neigen dazu, größer und weniger gut definiert zu sein als die durch Luftblasen verursachten.

Überhitzung

Das Experiment kann überhitzen, wenn ein erhöhter Widerstand aufgrund von sehr schlechter Leitfähigkeit oder mangelnder Kühlung besteht. Ersteres wird durch unzureichendes Tränken mit Puffer verursacht, letzteres durch das Nicht-Einbeziehen des Eispacks während des Transfers. Dies kann dazu führen, dass die Membran verbrennt oder das Gel schmilzt. In Bereichen, in denen das Gel geschmolzen ist, wird kein Proteintransfer stattfinden und diese werden leer erscheinen, wenn die Membran mit Ponceau S gefärbt wird.

Falsche Richtung der Migration

Proteine wandern von der Kathode zur Anode. Daher muss das Gel zur Anode und die Membran zur Kathode zeigen. Wenn der Stapel in der falschen Reihenfolge zusammengesetzt wird oder die Kassette falsch herum in den Behälter eingesetzt wird, können Proteine in Richtung des Filterpapiers wandern, anstatt in Richtung der Membran. Bei der Färbung mit Ponceau S wird die Membran leer erscheinen.

Nicht ausgerichtete Schichten

Wenn die Schichten nicht richtig ausgerichtet sind oder nicht fest genug zusammengehalten werden, können sie sich während des Experiments bewegen. Dies führt zu weniger scharf definierten Banden auf der Membran, wenn sie mit Ponceau S gefärbt wird.

Falsche Ausrichtung

Die Proteine werden in einer bestimmten Reihenfolge auf das SDS-PAGE-Gel geladen. Wenn das Gel während des Transferschrittes gedreht oder gespiegelt wird, können die Proben durcheinander geraten. Um dies zu vermeiden, sollte das Gel nicht symmetrisch aussehen. Dies kann erreicht werden, indem man eine Ecke abschneidet. Es kann auch hilfreich sein, die Membran mit einem Kugelschreiber zu markieren.