Aislamiento del ADN
Se puede aislar el ADN de las células con el método del fenol-cloroformo. Esta técnica produce un ADN genómico que contiene millones de genes. Para aislar un gen de interés específico del ADN genómico, se puede usar una PCR con cebadores específicos. Si el gen de interés se proporciona en un vector, se pueden usar enzimas de restricción específicas para aislarlo.
Extracción con fenol-cloroformo
Los ácidos nucleicos de las células pueden aislarse mediante el método del fenol-cloroformo. El fenol-cloroformo es una mezcla de fenol saturado de solución tampón y cloroformo en proporción 1:1.
El primer paso de la extracción es la lisis y homogeneización en solución acuosa. Luego, se añade fenol-cloroformo a la mezcla, creando dos fases que se separan aún más mediante centrifugación. El fenol purificado tiene una densidad de 1,07 g/cm3, mientras que el cloroformo tiene un densidad superior (1,47 g/cm3). Por tanto, la centrifugación tiene como resultado dos fases: la fase orgánica inferior y la fase acuosa superior.
Los ácidos nucleicos adquieren polaridad gracias a la carga negativa de la estructura principal del fosfato; por lo tanto, los ácidos nucleicos son solubles en la fase acuosa superior. Las proteínas contienen regiones hidrofóbicas que interactúan con el fenol y hacen que las proteínas se precipiten en la interfaz entre dos fases (a menudo como floculación blanca). Los lípidos también tienen una región hidrofóbica y se disolverán en la fase orgánica inferior. El pH de la mezcla determina la separación de los ácidos nucleicos. En un pH neutro, el ARN y el ADN se retienen en la fase acuosa superior, pero en un pH ácido, el ADN pasa a la fase orgánica inferior y el ARN permanece en la fase acuosa superior.
En el último paso, los ácidos nucleicos se recuperan de la fase acuosa por precipitación con isopropanol.
NanoDrop
La producción de ADN (o concentración de ADN) y la pureza se pueden determinar midiendo la absorbancia con un espectrofotómetro. El NanoDrop es un espectrofotómetro que puede medir la absorbancia desde 0,5 - 2 μl usando un sistema de retención de muestra. El sistema de retención de muestra permite medir muestras de alta concentración sin diluirlas. La absorbancia se mide a 260 nm (A260), en la que el ADN absorbe la luz con más fuerza. La cantidad de luz absorbida es proporcional a la cantidad de ADN de la muestra.
Esta relación se describe en la ley de Beer-Lambert: c = (A * ε)/b
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c : concentración de ácidos nucleicos en ng/μl
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A : absorbancia en UA
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ε : coeficiente de extinción dependiente de la longitud de onda en in ng-cm/μl
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b : camino óptico en cm
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El coeficiente de extinción del AND bicatenario es 50 ng-cm/μl
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En este caso, el camino óptico es de 10 mm
La pureza del ADN puede evaluarse midiéndola a λ = 280 nm, λ = 230 nm y λ = 320nm y calculando la relación para 260/280 nm, 260/230 nm y 260/320 nm. Los ácidos nucleicos absorben fuertemente la luz a 260 nm, mientras que los contaminantes orgánicos como el fenol y el Trizol absorben la luz a 230 nm, y las proteínas absorben la luz a 280 nm. Ni los ácidos nucleicos ni las proteínas absorben luz a 320 nm.
En el caso de 260/280, se suele aceptar como ADN puro una relación de 1,8. En el caso del ARN puro, la relación es de aproximadamente 2. En el caso de 260/320, una relación de 1,8 - 2,2 suele significar que el ácido nucleico se acepta como puro. En el caso de 260/230, una relación de <1,8 indica que hay una presencia significativa de contaminantes orgánicos.