Le séquençage de l'ADN

Le séquençage est une technique utilisée pour "lire" l'ordre précis des nucléotides dans un fragment d'ADN. Il est possible de séquencer de petits fragments d'ADN, des gènes entiers et même des génomes.

La technique de séquençage de l'ADN la plus utilisée est basée sur la terminaison de chaîne développée par Sanger. Cette méthode est très similaire à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), mais n'implique qu'une seule amorce qui s'hybride à proximité de la région d'intérêt à l'extrémité 3' de la matrice d'ADN (figure 1). Pendant la réaction de séquençage, un mélange de nucléotides normaux (dATP, dTTP, dCTP et dGTP) et de nucléotides "stop" (ddATP, ddTTP, ddCTP et ddGTP) est ajouté à la matrice d'ADN. Les nucléotides stop sont chacun marqués d'une couleur spécifique. À chaque cycle, l'ADN cible est répliqué par une ADN polymérase jusqu'à ce qu'un nucléotide stop soit ajouté, ce qui arrête l'élongation (terminaison de la chaîne). Après 35 cycles, un grand nombre de fragments de toutes les longueurs possibles sont produits. Ces fragments sont passés dans un gel d'acrylamide spécialisé qui permet de détecter leur longueur et leurs "bases terminales". Comme les fragments sont séparés en fonction de leur taille dans le gel, les nucléotides marqués sont détectés un par un, ce qui permet de reconstituer la séquence d'ADN précise du fragment.

Le but du séquençage est, par exemple, de prédire la séquence protéique d'un gène, de comparer des espèces au niveau des séquences (gènes ou génome), ou de rechercher une mutation.

Figure 1 : aperçu schématique de la méthode Sanger (terminaison de chaîne) pour le séquençage de l'ADN

Des fragments d'ADN de toutes les longueurs possibles sont produits pendant les cycles d'élongation, chacun étant terminé par un nucléotide stop coloré. Lorsque les fragments sont séparés en fonction de leur taille sur un gel, l'ordre des couleurs détectées indique la séquence d'ADN précise.