Ensamblaje 3A

El ensamblaje de tres antibióticos (ensamblaje 3A) es un método con el que se ensamblan dos BioBricks por medio de una clonación por enzimas de restricción. Tener tres resistencias a los antibióticos distintas permite seleccionar de manera eficiente los ensamblajes correctos por medio de antibióticos. El ensamblaje 3A usa los sitios de restricción del prefijo y el sufijo para ensamblar las dos partes.

Si los antibióticos se seleccionan de manera efectiva, se elimina la necesidad de purificar con gel y realizar la PCR a las colonias resultantes. En teoría, aproximadamente el 97 % de las colonias deberían corresponderse con el ensamblaje deseado.

Método

Para que el ensamblaje se realice con éxito, necesitas dos partes y una cadena con diferentes genes resistentes a los antibióticos (señalados con flechas amarillas en la Figura 1).

Figura 1: Ensamblaje 3A (créditos: iGEM.org)

• Digestión con enzimas de restricción

  • La parte izquierda de la muestra se recorta con EcoRI (E) y SpeI (S).

  • La parte derecha de la muestra se recorta con XbaI (X) y PstI (P).

  • La cadena del plásmido se recorta con EcoRI (E) y PstI (P). En el ejemplo de la Figura 1, se usa una cadena de plásmido linealizada. También se podría usar un plásmido con un gen ccdB.

• Las tres digestiones con enzimas de restricción se calientan para así matar a todas las enzimas de restricción.

• Ligación: Se combina una cantidad equimolar de los tres productos de la digestión en una reacción de ligación. El resultado deseado es la parte izquierda del voladizo de la SpeI de la muestra ligado con la parte derecha del voladizo de XbaI de la muestra, lo cual da lugar a una cicatriz que ninguna de nuestras enzimas puede seccionar. La nueva muestra compuesta se liga en la cadena del plásmido de construcción por los sitios EcoRI y PstI.

• Cuando la ligación se transforma en células y crece en las placas con antibiótico C, solo las colonias con la construcción correcta sobreviven.